Cas制造技术

提供了

【技术实现步骤摘要】
Cas蛋白、其相应的基因编辑系统及应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，具体地，涉及
Cas
蛋白
、
其相应的基因编辑系统及应用
。

技术介绍

[0002]Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)
系统是细菌和古细菌为了防御入侵噬菌体的
DNA
而形成的
。CRISPR
系统包括2个家族，1类系统进一步分为
I
型
、I II
型和
IV
型；2类系统分为
II
型
、V
型和
VI
型
。
其中
II
型最常见的为
CRISPR/Cas9
系统，
Cas9
蛋白可在反式编码小
RNA(tracrRNA)
的协助下将
pre
‑
crRNA
加工成与
tracrRNA
结合的成熟
crRNA。
之后，人们发现通过人工构建模拟
crRNA
‑
tracrRNA
复合体的单链嵌合体引导
RNA(guide RNA
，
gRNA)
，即可有效的介导
Cas9
蛋白对靶点的识别和切割，其中与靶点3′
端紧邻的3个碱基是5′‑<br/>NGG
‑3′
的形式，从而构成
Cas/crRNA
复合体识别靶点所需的
PAM(protospacer adjacent motif)
结构
。
[0003]Cas
蛋白是有效的
DNA
编辑工具，核酸序列的靶向编辑，例如，靶向切割靶基因以允许将特定修饰引入基因组
DNA
，以研究基因功能和基因表达
。
靶向编辑还可以用于靶向人类特定靶基因，以治疗遗传疾病，或用于在植物
(
例如农作物
)
或微生物
(
例如细菌
)
的基因组中引入有益突变
。
基因组编辑工具的开发为基于基因编辑的哺乳动物疗法和农业生物技术提供了新方法
。
在与脱氨酶融合时，
RNA
引导的
Cas
蛋白还可用于碱基编辑
。
[0004]目前已知的
CRISPR/Cas
存在各自的优缺点
。
目前对生物技术的发展仍需要开发新的
、
具有多样化特征的新型
CRISPR/Cas
系统
。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种新的
、
具有多样化特征的新型
CRISPR/Cas
系统
。
[0006]本专利技术的第一方面提供了一种
Cas
蛋白，所述蛋白选自下组：
[0007](a)
具有
SEQ ID NO:1
或2所示氨基酸序列的多肽；
[0008](b)
具有与
SEQ ID NO:1
或2所示氨基酸序列
≥80
％，
81
％，
82
％，
83
％，
84
％，
85
％，
86
％，
87
％，
88
％，
89
％，
90
％，
91
％，
92
％，
93
％，
94
％，
95
％，
96
％，
97
％，
98
％，
99
％或
99.5
％同源性
(
或同一性
)
的多肽，且所述多肽具有
SEQ ID NO:1
的生物学功能；
[0009](c)
将
SEQ ID NO:1
或2中任一所示氨基酸序列经过一个或多个
(
较佳地，1‑
20
个，更佳地为1‑
10
个
、
更佳地1‑5个
)
氨基酸残基的取代
、
缺失或添加而形成的，且保留
SEQ ID NO:1
或2的生物学功能的衍生多肽
。
[0010]本专利技术第二方面提供了一种融合蛋白，包含本专利技术第一方面所述的
Cas
蛋白；以及一个或多个功能结构域
。
[0011]在另一优选例中，所述功能结构域选自定位信号
、
报告蛋白
、Cas
蛋白靶向部分
、DNA
结合域
、
表位标签
、
转录激活域
、
转录抑制域
、
核酸酶
、
脱氨结构域
、
甲基化酶
、
脱甲基酶
、
转录释放因子
、HDAC、
裂解活性多肽
、
连接酶
、
整合酶
、
转座酶
、
重组酶
、
聚合酶和碱基切除修复抑制剂
(
如尿嘧啶
‑
DNA
糖基化酶抑制剂
(UGI))。
[0012]在另一优选例中，所述功能结构域包括以下一种或多种对靶序列的酶活性：甲基化酶活性
、
脱甲基酶活性
、
乙酰基转移酶活性
、
脱乙酰酶活性
、
激酶活性
、
磷酸酶活性
、
泛素连接酶活性
、
去泛素化活性
、
腺苷酸化活性
、
脱腺苷酸化活性
、SUMO
化活性
、
脱
SUMO
化活性
、
核糖基化活性
、
脱核糖基化活性
、
豆蔻酰化活性
、
脱豆蔻酰化活性
、
糖基化活性
(
例如，来自
O
‑
GlcNAc
转移酶
)
和脱糖基化活性
。
[0013]在另一优选例中，所述功能结构域选自腺苷脱氨酶催化结构域或胞苷脱氨酶催化结构域
。
[0014]在另一优选例中，所述腺苷脱氨酶催化结构域或胞苷脱氨酶催化结构域包括...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Cas
蛋白，其特征在于，所述蛋白选自下组：
(a)
具有
SEQ ID NO:1
或2所示氨基酸序列的多肽；
(b)
具有与
SEQ ID NO:1
或2所示氨基酸序列
≥80
％，
81
％，
82
％，
83
％，
84
％，
85
％，
86
％，
87
％，
88
％，
89
％，
90
％，
91
％，
92
％，
93
％，
94
％，
95
％，
96
％，
97
％，
98
％，
99
％或
99.5
％同源性
(
或同一性
)
的多肽，且所述多肽具有
SEQ ID NO:1
的生物学功能；
(c)
将
SEQ ID NO:1
或2中任一所示氨基酸序列经过一个或多个
(
较佳地，1‑
20
个，更佳地为1‑
10
个
、
更佳地1‑5个
)
氨基酸残基的取代
、
缺失或添加而形成的，且保留
SEQ ID NO:1
或2的生物学功能的衍生多肽
。2.
一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的
Cas
蛋白；以及一个或多个功能结构域
。3.
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的
Cas
蛋白或权利要求2所述的融合蛋白
。4.
一种分离的核酸分子，其特征在于，包含选自下列的序列，或由选自下列的序列组成：
(i)SEQ ID NO
：5或6所示的序列；
(ii)
与
SEQ ID NO
：5或6所示的序列相比具有一个或多个碱基的置换
、
缺失或添加
(
例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或
10
个碱基的置换
、
缺失或添加
)
的序列；
(iii)
与
SEQ ID NO
：5或6所示的序列具有至少
20
％
、
至少
30
％
、
至少
40
％
、
至少
50
％
、
至少
60
％
、
至少
70
％
、
至少
80
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％的序列同一性的序列；
(iv)
在严格条件下与
(i)
‑
(iii)
任一项中所述的序列杂交的序列；或
(v)(i)
‑
(iii)
任一项中所述的序列的互补序列；并且，
(ii)
‑
(v)
中任一项所述的序列基本保留了其所源自的序列的生物学功能；例如，所述分离的核酸分子是
RNA
；例如，所述分离的核酸分子包含
CRISPR/Cas
系统中的同向重复序列
。5.
一种向导
RNA(gRNA)
，其特征在于，所述向导
RNA
包括能够结合权利要求1所述
Cas
蛋白的同向重复
(Direct Repeat
，
DR)
序列和能够靶向靶序列的间隔
(spacer)
序列
。6.
一种复合物，其特征在于，包含：
(i)
蛋白组分，选自下组：权利要求1所述的
Cas
蛋白
、
权利要求2所述的融合蛋白
、
或其组合；和
(ii)
核酸组分，选自下组：权利要求5所述的向导
RNA
，编码权利要求5所述的向导
RNA
的核酸，权利要求5所述的向导
RNA
的前体
RNA
，编码权利要求5所述的向导
RNA
的前体
RNA
核酸
、
或其组合；其中，所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物
。7.
一种载体，其特征在于，包含权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的向导
RNA。8.
一种
CRISPR
‑
Cas
组合物，其特征在于，包含：
(i)
第一组分，选自下组：权利要求1所述的
Cas
蛋白
、
权利要求2所述的融合蛋白
、
编码权利要求1所述的
Cas
蛋白或权利要求2所述的融合蛋白的核苷酸序列，以及其任意组合；和
(ii)
第二组分，所述第二组分为包含一种或多种权利要求5所述的向导
RNA
，或者编码
所述包含一种或多种权利要求5所述的向导
RNA
的核苷酸序列；所述向导
RNA
能够与
(i)
中所述的蛋白或蛋白变体或融合蛋白形成复合物
。9.
一种
CRISPR
‑
Cas
系统，其特征在于，包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(i)
第一核酸，其为编码权利要求1所述的
Cas
蛋白或权利要求2所述的融合蛋白的核苷酸序列；任选地所述第一核酸可操作地连接至第一调节元件；以及
(ii)
第二核酸，其编码包含权利要求5所述的向导
RNA
的核苷酸序列；任选地所述第二核酸可操作地连接至第二调节元件；其中：所述第一核酸与第二核酸存在于相同或不同的载体上；所述向导
RNA
能够与
(i)
中所述的
Cas
蛋白或融合蛋白形成复合物
。10.
一种试剂盒，其特征在于，包括一种或多种选自下列的组分：权利要求1所述的
Cas
蛋白
、
权利要求2所述的融合蛋白
、
权利要求3所述的多核苷酸
、
权利要求6所述的复合物
、
权利要求7所述的载体
、
权利要求8所述的
CRISPR
‑
Cas
组合物或权利要求9所述的系统
。11.
一种递...

【专利技术属性】
技术研发人员：王威，
申请(专利权)人：尧唐上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：