一种核酸工具酶活性的光调控方法技术

本发明专利技术涉及一种核酸工具酶活性的光调控方法，其使用核酸工具酶活性抑制剂进行调控，所述核酸工具酶活性抑制剂包括封闭序列，所述封闭序列为至少具有光响应基团以及硫代磷酸两种修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物，所述封闭序列用于与核酸工具酶形成蛋白核酸复合物而使其酶活性沉默；所述光响应基团具有光照断键特性，其在经光激发后断裂，使所述封闭序列与所述核酸工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默，实现了对核酸工具酶的活性调控；且所述封闭序列无需根据不同的核酸工具酶进行调整，普适性高，有助于节约成本，并简化操作步骤，同时仅需使用光照的方式即可实现调控，且是非接触式操作，具有简单

【技术实现步骤摘要】
一种核酸工具酶活性的光调控方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别是涉及一种核酸工具酶活性的光调控方法
。

技术介绍

[0002]核酸工具酶是一种以核酸为催化底物的酶，具有特异性的序列识别能力，高效的催化活性以及良好的生物相容性，能够对核酸进行切割
、
连接
、
扩增及修饰等作用
。
基于此，核酸工具酶在核酸
,
甚至蛋白质和小分子等生物功能分子的分析检测中广泛应用
。CRISPR
‑
Cas
酶是近年来开发的一类新型核酸工具酶，其在基因编辑
、
调控和诊断等领域的应用发展，极大地推动了生物
的革命
。
虽然核酸工具酶已具有广泛的应用性，但是酶分子在发挥功能的时候往往会产生非特异性的酶促反应，从而损害其工作性能，因此，对核酸工具酶活性进行调控对于开发更先进的分子诊断方法具有重要的意义
。
[0003]光控技术是一种时间和空间上可控
、
非侵入性
、
细胞毒性低的控制方法
。
光控技术目前已经被应用到核酸工具酶活性的调控当中
。
目前，基于光响应的核酸酶活性调控方法主要有两种：
1)
通过直接控制酶的活性来阻断其功能
。
其中，一种经典方法是将光可移除的保护基团
(
即笼化基团
)
通过化学修饰在具有活性的酶分子上，使其暂时失去活性
。
这种笼化基团通常由芳香环组成，可通过共价的方式与特定的氨基酸残基结合，进而抑制它们的活性
。
当受到光照射
(
最常见的为紫外灯
)
时，这些分子发生光解裂解从而解离，酶恢复到其自然构象
(
通常称为脱笼化
)
，然后酶的催化功能恢复
。
然而，上述方法需要事先了解酶分子的结构信息才能实现光笼化修饰，实验操作复杂，不利于大范围的应用推广
。2)
另外一种光调控的策略是通过沉默引导
RNA
的活性来间接阻断酶的活性
。
这种方法主要是应用到
CRISPR
‑
Cas
酶当中
。
相较于光笼化基团的蛋白修饰而言，调控引导
RNA
的方法在实际操作中更为简便，但是该方法不是一个通用的酶活性调控方法，需根据实验过程中所使用的引导
RNA
的不同进行相应的调整
。
[0004]核酸中的硫代磷酸
(PS)
修饰是一种将核苷酸骨架上的一个非桥连氧原子置换为硫原子的核酸修饰物
。PS
修饰核酸
(PS
‑
DNA)
不但稳定性增强且保持了核酸链原有的负电性和生物活性
。PS
‑
DNA
能够通过静电和疏水相互作用与蛋白结合，这一特性使得
PS
‑
DNA
表现出通用且高亲和的蛋白结合能力
。
特别地，在对
gene 5
蛋白的分析研究中发现，
PS
‑
DNA
与该蛋白的相互作用力远大于普通寡核苷酸链
(PO
‑
DNA)
与该蛋白的相互作用力，其强度大约是
PO
‑
DNA
与该蛋白相互作用力的
300
倍
。
此外，进一步的实验发现，
PS
‑
DNA
与蛋白的结合，能够显著抑制蛋白的活性
。
这样一种极高的结合稳定性以及蛋白活性抑制效果使得
PS
‑
DNA
可以用来沉默核酸工具酶的活性
。
[0005]综上所述，基于
PS
修饰的核苷酸序列，开发一种简单
、
方便
、
快速
、
通用
、
毒性低的酶活性调控方法具有广阔的应用前景
。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的在于，提供一种核酸工具酶活性的光调控方法，其能够实现
核酸工具酶活性的精准调控
。
[0007]一种核酸工具酶活性的光调控方法，其使用核酸工具酶活性抑制剂进行调控，所述核酸工具酶活性抑制剂包括封闭序列，所述封闭序列为至少具有光响应基团以及硫代磷酸两种修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物，所述封闭序列用于与核酸工具酶形成蛋白核酸复合物而使其酶活性沉默；所述光响应基团具有光照断键特性，其在经光激发后断裂，使所述封闭序列与所述核酸工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默；
[0008]所述光调控方法具体包括以下步骤：
[0009]将封闭序列以及核酸工具酶置于缓冲液中混合配制成预混反应液；
[0010]所述预混反应液中，封闭序列与核酸工具酶形成蛋白核酸复合物而使其酶活性沉默；
[0011]使用
UV
光对所述预混反应液进行照射，封闭序列中的光响应基团经光激活后断裂，使封闭序列与核酸工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默，核酸工具酶活性恢复
。
[0012]本专利技术所述核酸工具酶活性的光调控方法，其使用的核酸工具酶活性抑制剂包括有封闭序列，所述封闭序列是含有光响应基团以及硫代磷酸两种修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物；硫代磷酸修饰不仅使封闭序列能够与核酸工具酶稳定结合，进而能够沉默该蛋白活性，且能够增强封闭序列的稳定性，提高其对于核酸酶的抵抗力；同时封闭序列中的光响应基团具有光照断键特性，其在受到
UV
光照后断键，封闭序列断裂为核苷酸小片段，断裂后的核苷酸小片段或核苷酸类似物小片段与核酸工具酶的结合稳定性降低，使得核苷酸小片段或核苷酸类似物小片段也从核酸工具酶表面游离到反应体系中，最终实现核酸工具酶的去失活，恢复活性后的核酸工具酶进而能够对各项基因工程反应进行催化
。
[0013]所述核酸工具酶酶活性抑制剂利用其自身光照断键特性，可利用光照射的方式实现对封闭序列长度的调控，当未受到光照激发时，封闭序列作为整体并呈长链状态，其能够与核酸工具酶的复合而使酶活性沉默，并在经光照后断裂形成若干小片段从而与核酸工具酶脱离而使酶活性去沉默，实现了对核酸工具酶的活性调控；且所述封闭序列无需与核酸工具酶一一对应匹配，无需根据不同的核酸工具酶进行调整，普适性高，有助于节约成本，并简化操作步骤，同时仅需使用光照的方式即可实现调控，且是非接触式操作，具有简单
、
便捷且快速的特点
。
[0014]进一步地，所述封闭序列为单碱基重复序列或随机碱基序列
。
[0015]进一步地，所述封闭序列的长度为5～
200nt。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种核酸工具酶活性的光调控方法，其特征在于：使用核酸工具酶活性抑制剂进行调控，所述核酸工具酶活性抑制剂包括封闭序列，所述封闭序列为至少具有光响应基团以及硫代磷酸两种修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物，所述封闭序列用于与核酸工具酶形成蛋白核酸复合物而使其酶活性沉默；所述光响应基团具有光照断键特性，其在经光激发后断裂，使所述封闭序列与所述核酸工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默；所述光调控方法具体包括以下步骤：将封闭序列以及核酸工具酶置于缓冲液中混合配制成预混反应液；所述预混反应液中，封闭序列与核酸工具酶形成蛋白核酸复合物而使酶活性沉默；使用
UV
光对所述预混反应液进行照射，封闭序列中的光响应基团经光激活后断裂，使封闭序列与核酸工具酶相互脱离而使其酶活性去沉默，核酸工具酶活性恢复
。2.
根据权利要求1所述的核酸工具酶活性的光调控方法，其特征在于：所述封闭序列为单碱基重复序列或随机碱基序列
。3.
根据权利要求2所述的核酸工具酶活性的光调控方法，其特征在于：所述封闭序列的长度为5～
200nt。4.
根据权利要求2所述的核酸工具酶活性的光调控方法，其特征在于：所述光响应基团为光可裂解的基团，所述光响应基团为嵌入修饰于所述封闭序列内
。5.
根据权利要求3所述的核酸工具酶活性的光调控方法，其特征在于：所述封闭序列中光响应基团的修饰个数为3～
199
个
。6.
根据权利要求4所述的核酸工具酶活性的光调控方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小明，胡梦露，张冰妮，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：