Cas12g制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
Biotechnologies
公司的
Yan
等人发现，
RspCas13d
的辅助蛋白
RspWYL1
增强了
RspCas13d
的
RNA
靶向和降解功能
。RspWYL1
蛋白同时也增强了
EsCas13d
的活性，表明含有
WYL
结构域的蛋白可能是
Cas13d
的活性调控元件
。
这种性质使得
WYL
蛋白成为
anti
‑
CRISPR
蛋白的有趣对应物
。Salk
研究所的
Konermann
等人则发现，与核定位信号
(NLS)
融合的
CasRx
和
AdmCas13d
能够在哺乳动物细胞中很好地发挥功能
。
他们在
HEK293
细胞中开展了
mCherry
报告基因检测，通过流式分析发现
CasRx
和
AdmCas13d
分别使
mCherry
蛋白活性减少了
92
％和
87
％
。
此外，科学家还将
CasRx
与多种
RNA
调控方法进行比较，包括
RNA
干扰
、dCas9
介导的转录抑制
(CRISPRi)
以及
Cas13a/Cas13b RNA
敲低
。
结果发现，
CasRx
是明显的赢家，敲低效率为
96
％，而
shRNA
为
65
％
、CRISPRi
为
53
％，其他
Cas13a
和
Cas13b
大约在
66
‑
80
％
。
此外，
CasRx
也表现出极高的
on
‑
target
效率
。shRNA
处理产生
500
‑
900
个明显的脱靶，而
CasRx
为零脱靶
。
[0005]Cas13
家族蛋白还有一种独特的活性
——
旁系切割
(collateral cleavage)
，即在
crRNA
和靶标
RNA
同时存在的情况下随机切割体系中其他的单链
RNA(ssRNA)。
如果将
CRISPR
‑
Cas13
系统应用于动物或人类疾病治疗时，这种不受控的
、
随机切割
ssRNA
的活性就成了致命缺陷
。
这种缺陷使
Cas13
家族在原核细胞或真核细胞内发挥对靶向
ssRNA
的切割作用时，也会对非靶向
RNA
产生切割作用，这种效应会对细胞产生一定的影响，比如会造成细胞生长缓慢
、
休眠，甚至引起细胞死亡
。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种
Cas12g
在制备哺乳动物细胞
RNA
编辑产品中的应用，本专利技术哺乳动物密码子优化的
Cas12g
能够对哺乳动物细胞
RNA
进行编辑，具体可以将相关转录本水平敲低至
30
％，相比较
RfxCas13d
具有较小的细胞毒性和旁切效应；且并未发现对基因组
DNA
的脱靶情况
。
[0008]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009]本专利技术第一方面提供了一种
Cas12g
在制备哺乳动物细胞
RNA
编辑产品中的应用
。
[0010]优选地，哺乳动物密码子优化的
Cas12g
在制备哺乳动物细胞
RNA
编辑产品中的应用；
[0011]优选地，所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
至少包括
SEQ ID NO:1
所示的氨基酸序列
。
[0012]优选地，表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸在制备哺乳动物细胞
RNA
编辑产品中的应用
。
[0013]优选地，表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸至少包括如
SEQ ID NO:2
所示的核苷酸序列
。
[0014]优选地，所述产品包括重组质粒
。
[0015]优选地，所述重组质粒包括表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸序列和载体
。
[0016]优选地，所述载体包括腺相关病毒
、
腺病毒
、
慢病毒
、
逆转录病毒
、
单纯孢疹病毒和溶瘤病毒
。
[0017]优选地，所述重组质粒还包括
sgRNA
和表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的
核苷酸序列有效链接的启动子；
[0018]所述启动子为组成型启动子
、
诱导型启动子
、
组织特异性启动子
、
嵌合型启动子或发育特异性启动子
。
[0019]本专利技术第二方面提供了一种用于哺乳动物细胞
RNA
编辑的重组质粒，所述重组质粒包括表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸序列和载体
。
[0020]优选地，所述重组质粒还包括
sgRNA
和表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸序列有效链接的启动子；
[0021]所述启动子为组成型启动子
、
诱导型启动子
、
组织特异性启动子
、
嵌合型启动子或发育特异性启动子；
[0022]所述载体包括腺相关病毒
、
腺病毒
、
慢病毒
、
逆转录病毒
、
单纯孢疹病毒和溶瘤病毒；
[0023]所述哺乳动物细胞
RNA
包括
mRNA
或
ncRNA
；
[0024]所述
ncRNA
包括
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Cas12g
在制备哺乳动物细胞
RNA
编辑产品中的应用
。2.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于，哺乳动物密码子优化的
Cas12g
在制备哺乳动物细胞
RNA
编辑产品中的应用；优选地，所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
至少包括
SEQ ID NO:1
所示的氨基酸序列
。3.
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸在制备哺乳动物细胞
RNA
编辑产品中的应用
。4.
根据权利要求3所述的应用，其特征在于，表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸至少包括如
SEQ ID NO:2
所示的核苷酸序列
。5.
根据权利要求1～4中任一所述的应用，其特征在于，所述产品包括重组质粒
。6.
根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组质粒包括表达所述哺乳动物密码子优化的
Cas12g
的核苷酸序列和载体
。7.
根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体包括腺相关病毒
、
腺病毒
、
慢病毒
、
逆转录病毒
、
单纯孢疹病毒和溶瘤病毒
。8.
根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组质粒还包括
sg...

【专利技术属性】
技术研发人员：李俊，滕建瑾，吴承岳，程昕，张恒，伍柳兴，徐冬晴，
申请(专利权)人：天津医科大学，
类型：发明
国别省市：