突变的制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复

【技术实现步骤摘要】
突变的CRISPR
‑
Cas蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复
(CRISPR)


。
具体而言，本专利技术涉及一种活性提高的突变的
Cas
‑
sf0005
蛋白及其应用
。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas
技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过
RNA
引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割
DNA
产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑
。
[0003]CRISPR/Cas9
系统是最常用的
II
型
CRISPR
系统，它识别3’‑
NGG
的
PAM
基序，对靶标序列进行平末端切割
。CRISPR/Cas Type V
系统是一类新发现的
CRISPR
系统，它具有5’‑
TTN
的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如
Cpf1,C2c1,CasX,CasY。
然而目前存在的不同的
CRISPR/Cas
各有不同的优点和缺陷
。
例如
Cas9,C2c1
和
CasX
均需要两条
RNA
进行指导
RNA
，而
Cpf1/>只需要一条指导
RNA
而且可以用来进行多重基因编辑
。CasX
具有
980
个氨基酸的大小，而常见的
Cas9
，
C2c1
，
CasY
和
Cpf1
通常大小在
1300
个氨基酸左右
。
此外，
Cas9
，
Cpf1
，
CasX
，
CasY
的
PAM
序列都比较复杂多样，而
C2c1
识别严谨的5’‑
TTN
，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应
。
[0004]中国专利技术专利
CN114438055A
中公开了一种
Cas
蛋白
Cas
‑
sf0005
，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，但是，其编辑活性并不高，为了提高该蛋白的编辑效率，本申请对该蛋白进行了优化，提高了其在真核细胞中的编辑效率
。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对
Cas
‑
sf0005
蛋白的定点突变，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围
。
[0006]Cas
效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一种活性改善或活性提高或编辑活性提高的
Cas
突变蛋白，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任一或任意几个
(
例如，任意2个
、
任意3个
、
任意4个或任意5个
)
氨基酸位点处存在突变：第6位
、
第
149
位
、
第
351
位
、
第
196
位
、
第
261
位
、
第
549
位
、
第
667
位
、
第
164
位
、
第
491
位或第
607
位
。
[0008]上述氨基酸位点是指
SEQ ID No.1
的
N
端起的位点
。
[0009]在一个实施方式中，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任意2个氨基酸位点处存在突变：第6位
、
第
149
位
、
第
351
位
、
第
196
位
、
第
261
位
、
第
549
位
、
第
667
位
、
第
164
位
、
第
491
位或第
607
位
。
[0010]优选的，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的第
351
位氨基酸位点处存在突变，在此基础上，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任意1个氨基酸位
点处存在突变：第6位
、
第
149
位
、
第
196
位
、
第
261
位
、
第
549
位
、
第
667
位
、
第
164
位
、
第
491
位或第
607
位
。
[0011]在一个实施方式中，所述
Cas
突变蛋白在上述第6位氨基酸位点和第
351
位氨基酸位点处存在突变；或者，所述
Cas
突变蛋白在上述第
351
位氨基酸位点和第
149
位氨基酸位点处存在突变；或者，所述
Cas
突变蛋白在上述第
351
位氨基酸位点和第
196
位氨基酸位点处存在突变；或者，所述
Cas
突变蛋白在上述第
149
位氨基酸位点和第
261
位氨基酸位点处存在突变
。
[0012]在一个实施方式中，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第6位
、
第
149
位和第
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Cas
突变蛋白，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任一或任意几个
(
例如，任意2个
、
任意3个
、
任意4个或任意5个
)
氨基酸位点处存在突变：第6位
、
第
149
位
、
第
351
位
、
第
196
位
、
第
261
位
、
第
549
位
、
第
667
位
、
第
164
位
、
第
491
位或第
607
位
。2.
根据权利要求1所述的
Cas
突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的第
351
位氨基酸位点处存在突变；所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任意1个氨基酸位点处存在突变：第6位
、
第
149
位
、
第
196
位
、
第
261
位
、
第
549
位
、
第
667
位
、
第
164
位
、
第
491
位或第
607
位
。3.
根据权利要求1所述的
Cas
突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第6位
、
第
149
位和第
351
位
。4.
根据权利要求3所述的
Cas
突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，还在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任意1个氨基酸位点处存在突变：第
279
位
、
第
667
位或第
713
位；优选，第
667
位氨基酸位点
。5.
一种
Cas
突变蛋白，所述
Cas
突变蛋白选自以下
I
‑
III
任意一组：
I、
由
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个
(
例如，任意2个
、
任意3个
、
任意4个或任意5个
)
氨基酸位点处产生突变得到的
Cas
突变蛋白：第6位
、
第
149
位
、
第
351
位
、
第
196
位
、
第
261
位
、
第
549
位
、
第
667
位
、
第
164
位
、
第
491
位或第
607
位；
II、
与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有
I
中所述的突变位点；并且，与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％
、
或至少
99
％的序列同一性的
Cas
突变蛋白；
III、
与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有
I
中所述的突变位点；并且，与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换
、
缺失或添加的序列；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或
10
个氨基酸的置换
、
缺失或添加
。6.
一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1‑5任一所述的
Cas
突变蛋白以及其他的修饰部分；优选的，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽
、
可检测的标记或其任意组合
。7.<...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：