可降低基因编辑脱靶率的基因编辑蛋白变体制造技术

本发明专利技术涉及可降低基因编辑脱靶率的基因编辑蛋白变体

【技术实现步骤摘要】
可降低基因编辑脱靶率的基因编辑蛋白变体


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，涉及可降低基因编辑脱靶率的基因编辑蛋白变体
。

技术介绍

[0002]基因编辑是指对
DNA
序列进行删除
、
插入或替换等操作，广泛应用于基因功能研究
、
疾病模型建立
、
疾病治疗以及转基因动植物工程等等
。
第一代基因编辑技术基于锌指核酸酶
(Zinc Finger Nuclease
，
ZFN)
，
ZFN
含有一个能够特异性识别序列的
DNA
锌指结合域，通过改造这个区域可以实现靶向不同的
DNA
序列
。
一个
DNA
锌指结合域一般由多个锌指结构组成，每个锌指结构识别3个碱基，因此
ZNF
的靶序列必须是3的倍数
。
由于
ZNF
的识别结构域存在上下文依赖效应，其设计和筛选的难度非常大，应用范围受到限制，并且该技术还存在成本高
、
劳动量大
、
耗时长
、
成功率低
、
易脱靶
、
细胞毒性大等缺陷
。
第二代基因编辑技术基于转录激活样效用因子核酸酶
(TALEN
，
Transcription Activator
‑
like effector Nuclease)
，其识别靶位点
DNA
特异性的单位模块是间隔
32
个恒定氨基酸残基的二联氨基酸，不同的二联氨基酸能够与
AGTC
四个核苷酸碱基一一对应
。
根据靶标
DNA
的序列反推出对应的二联氨基酸序列，从而构成
TALEN
靶点识别模块
。
该模块进行组装需要大量的分子克隆和测序操作，从而限制了该技术的推广
。
[0003]第三基因编辑技术基于
CRISPR
‑
Cas
技术，该技术通过
guide RNA
实现特异性识别靶标
DNA
序列，
guide RNA
的设计和合成工作量远小于
TALEN
和
ZFN
技术的
DNA
识别模块的构建过程
。Guide RNA
能够结合具有核酸酶活性的
Cas
蛋白，并引导其对靶标
DNA
进行切割
。
[0004]目前基因编辑蛋白还是存在一定程度的脱靶率
。
当基因编辑蛋白
(
比如
Cas12a)
与
guide RNA
和靶标
DNA
形成三元复合体后，不仅对靶标
DNA
具有
cis
切割活性，还对体系中存在的单链
DNA
具有非特异的
trans
切割活性
。
当
DNA
处于复制或转录状态时，双链
DNA
会解链成单链
DNA
，此时基因编辑蛋白
(
比如
Cas12a)
的
trans
切割活性可能会导致这些
DNA
被切割，因而导致脱靶产生，并且引起细胞毒问题
。
因此需要消除基因编辑蛋白
(
比如
Cas12a)
的
trans
切割活性以解决脱靶引起的细胞毒问题
。
[0005]因此，本领域迫切需要开发消除基因编辑蛋白
(
比如
Cas12a)
的
trans
切割活性以解决脱靶引起的细胞毒问题的方法
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种降低乃至消除基因编辑蛋白
(
比如
Cas12a)
的
trans
切割活性以解决脱靶引起的细胞毒问题的方法
。
[0007]本专利技术第一方面提供了一种基因编辑蛋白变体，所述变体为具有
cis
切割活性的非天然蛋白，且所述变体相较于其野生型基因编辑蛋白的
trans
切割活性降低，并且所述变体在野生型基因编辑蛋白的选自下组一个或多个与切割活性相关的核心氨基酸位点发生突变：
[0008]对应于
FnCas12a
第
1081
位的苯丙氨酸
(F)
位点；和
/
或
[0009]对应于
FnCas12a
第
1069
位的赖氨酸
(K)
位点
。
[0010]在另一优选例中，所述变体相较于其野生型基因编辑蛋白的
trans
切割活性降低指与野生型的基因编辑蛋白相比，所述变体的
trans
切割活性降低
≥50
，较佳地
≥80
％，更佳地，
≥90
％或
100
％
。
[0011]在另一优选例中，所述
FnCas12a
第
1081
位的苯丙氨酸
(F)
突变为选自下组的一种或多种氨基酸：精氨酸
(R)、
酪氨酸
(Y)、
色氨酸
(W)、
谷氨酰胺
(Q)、
天冬酰胺
(N)、
赖氨酸
(K)、
谷氨酸
(E)、
天冬氨酸
(D)
或其组合
。
[0012]在另一优选例中，所述
FnCas12a
第
1069
位的赖氨酸
(K)
突变为选自下组的一种或多种氨基酸：精氨酸
(R)、
酪氨酸
(Y)、
谷氨酰胺
(Q)、
天冬酰胺
(N)、
赖氨酸
(K)、
谷氨酸
(E)、
天冬氨酸
(D)
或其组合
。
[0013]在另一优选例中，所述
FnCas12a
第
1081
位的苯丙氨酸
(F)
突变为精氨酸
(R)。
[0014]在另一优选例中，所述
FnCas12a
第
1069
位的赖氨酸
(K)
突变为精氨酸
(R)。
[0015]在另本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基因编辑蛋白变体，其特征在于，所述变体为具有
cis
切割活性的非天然蛋白，且所述变体相较于其野生型基因编辑蛋白的
trans
切割活性降低，并且所述变体在野生型基因编辑蛋白的选自下组一个或多个与切割活性相关的核心氨基酸位点发生突变：对应于
FnCas12a
第
1081
位的苯丙氨酸
(F)
位点；和
/
或对应于
FnCas12a
第
1069
位的赖氨酸
(K)
位点
。2.
一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的变体
。3.
一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的多核苷酸
。4.
一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸
。5.
一种基因编辑蛋白变体的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)
在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达所述的基因编辑蛋白变体；和
(b)
分离所述的基因编辑蛋白变体
。6.
一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包括权利要求1所述的基因编辑蛋白变体
。7.
一种基因编辑系统，其特征在于，包括：权利要求1所述的基因编辑蛋白变体
、
或其编码基因或其表达载体；和
gRNA
或其表达载体，和
/
或其用于靶标位点断裂修复的寡核苷酸或核酸片段或质粒
。8.
一种组合物，其特征在于，包括：权利要求7所述的系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹蕾，
申请(专利权)人：上海吐露港生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：