用CAS酶进行多重编辑制造技术

本文描述了用于使用Cas酶进行多重编辑或使用Cas酶编辑T细胞或相关细胞的方法、组合物和系统。和系统。和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用CAS酶进行多重编辑
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求于2021年3月19日提交的题为“使用CAS酶进行多重编辑(MULTIPLEX EDITING WITH CAS ENZYMES)”的美国临时申请第63/163,510号的权益；于2021年5月10日提交的题为“使用CAS酶进行多重编辑(MULTIPLEX EDITING WITH CAS ENZYMES)”的美国临时申请第63/186,506号的权益；以及于2021年9月8日提交的题为“使用CAS酶进行多重编辑(MULTIPLEX EDITING WITH CAS ENZYMES)”的美国临时申请第63/241,916号的权益；所述美国临时申请中的每个美国临时申请通过引用整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此通过引用整体并入。创建于2022年3月17日的所述ASCII副本命名为55921
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技术介绍

[0005]Cas酶以及其相关的成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)向导核糖核酸(RNA)似乎是原核免疫系统的普遍组分(约45％的细菌，约84％的古细菌)，用于通过CRISPR
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RNA引导的核酸切割来保护此类微生物免受非自身核酸的侵害，如传染性病毒和质粒。虽然编码CRISPR RNA元件的脱氧核糖核酸(DNA)元件在结构和长度上可能相对保守，但其CRISPR相关(Cas)蛋白是高度多样化的，含有多种核酸相互作用结构域。虽然早在1987年就观察到CRISPR DNA元件，但CRISPR/Cas复合物的可编程核酸内切酶切割能力直到最近才被认识到，从而引起重组CRISPR/Cas系统在各种DNA操纵和基因编辑应用中的使用。

技术实现思路

[0006]在一些方面，本公开提供了一种编辑细胞内的两个或更多个基因座的方法，所述方法包括使以下与所述细胞接触：(a)2类II型Cas核酸内切酶复合物，所述2类II型Cas核酸内切酶复合物包括：(i)2类II型Cas核酸内切酶；以及(ii)第一工程化向导RNA，所述第一工程化向导RNA包括：RNA序列，所述RNA序列被配置成与所述2类II型Cas核酸内切酶结合，以及间隔子序列，所述间隔子序列被配置成与第一组一个或多个靶基因座杂交；(b)2类V型Cas核酸内切酶复合物，所述2类V型Cas核酸内切酶复合物包括：(i)2类V型Cas核酸内切酶；以及(ii)第二工程化向导RNA，所述第二工程化向导RNA包括：RNA序列，所述RNA序列被配置成与所述2类V型Cas核酸内切酶结合，以及间隔子序列，所述间隔子序列被配置成与第二组一个或多个靶基因座杂交。在一些实施例中，所述2类II型Cas核酸内切酶不是Cas9核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类II型Cas核酸内切酶是Cas12a核酸内切酶。在一些实施例中，所述2类II型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO:1或4中的任一个或其变体具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO:7或其变体具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述第一工程化向导RNA或所述第二工程化向导RNA包括与SEQ ID NO:3、6或9中的任一个具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。在一些实施例中，所述方法以至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的效率编辑所述第一基因座的基因组序列，和/或以至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的效率编辑所述第二基因座的基因组序列。在一些实施例中，所述第一RNA引导的核酸内切酶或所述第二RNA引导的核酸内切酶以200pmol或更低、100pmol或更低、50pmol或更低、25pmol或更低、5pmol或更低或1pmol或更低的浓度引入。在一些实施例中，所述细胞内的脱靶位点以小于0.2％的频率被破坏，如通过全基因组脱靶双链断裂分析测定的。在一些实施例中，所述细胞内的脱靶位点以小于0.01％的频率被破坏，如通过全基因组脱靶双链断裂分析测定的。在一些实施例中，所述第一组一个或多个靶基因座或所述第二组一个或多个靶基因座包括T细胞受体(TCR)基因座。在一些实施例中，被配置成与所述第一组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列或被配置成与所述第二组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列与SEQ ID NO:10
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15中的任一个、其补体或其反向补体具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述第一组一个或多个靶基因座或所述第二组一个或多个靶基因座包括白蛋白(ALB)基因座。在一些实施例中，被配置成与所述第一组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列或被配置成与所述第二组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列与SEQ ID NO:17
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19中的任一个、其补体或其反向补体具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述第一组一个或多个靶基因座或所述第二组一个或多个靶基因座包括核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)基因座。在一些实施例中，被配置成与所述第一组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列或被配置成与所述第二组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列与SEQ ID NO:16、20、21或22中的任一个、其补体或其反向补体具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施例中，所述方法进一步包括将包括以下的供体DNA序列引入到所述细胞：编码异源工程化T细胞受体分子的开放阅读框、包括位于所述第一组一个或多个靶基因座的第一侧的DNA序列的第一同源臂和包括位于所述第一组一个或多个靶基因座的第二侧的DNA序列的第二同源臂。在一些实施例中，编辑包括插入插入和缺失(indel)、提前终止密码子、错义密码子、移码突变、腺嘌呤脱氨基化、胞嘧啶脱氨基化或其任何组合。
[0007]在一些方面，本公开提供了一种制备糖皮质激素抵抗性工程化T细胞的方法，所述方法包括将以下引入到T细胞或其前体：(a)靶向T细胞受体(TC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编辑细胞内的两个或更多个基因座的方法，所述方法包括使以下与所述细胞接触：(a)2类II型Cas核酸内切酶复合物，所述2类II型Cas核酸内切酶复合物包括：(i)2类II型Cas核酸内切酶；以及(ii)第一工程化向导RNA，所述第一工程化向导RNA包括：RNA序列，所述RNA序列被配置成与所述2类II型Cas核酸内切酶结合，以及间隔子序列，所述间隔子序列被配置成与第一组一个或多个靶基因座杂交；(b)2类V型Cas核酸内切酶复合物，所述2类V型Cas核酸内切酶复合物包括：(i)2类V型Cas核酸内切酶；以及(ii)第二工程化向导RNA，所述第二工程化向导RNA包括：RNA序列，所述RNA序列被配置成与所述2类V型Cas核酸内切酶结合，以及间隔子序列，所述间隔子序列被配置成与第二组一个或多个靶基因座杂交。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述2类II型Cas核酸内切酶不是Cas9核酸内切酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述2类II型Cas核酸内切酶是Cas12a核酸内切酶。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述2类II型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO:1或4中的任一个或其变体具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述2类V型Cas核酸内切酶包括与SEQ ID NO:7或其变体具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一工程化向导RNA或所述第二工程化向导RNA包括与SEQ ID NO:3、6或9中的任一个具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法以至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的效率编辑所述第一基因座的基因组序列，和/或以至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的效率编辑所述第二基因座的基因组序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶或所述第二RNA引导的核酸内切酶以200pmol或更低、100pmol或更低、50pmol或更低、25pmol或更低、5pmol或更低或1pmol或更低的浓度引入。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述细胞内的脱靶位点以小于0.2％的频率被破坏，如通过全基因组脱靶双链断裂分析测定的。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞内的脱靶位点以小于0.01％的频率被破坏，如通过全基因组脱靶双链断裂分析测定的。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一组一个或多个靶基因座或所述第二组一个或多个靶基因座包括T细胞受体(TCR)基因座。12.根据权利要求11所述的方法，其中被配置成与所述第一组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列或被配置成与所述第二组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序
列与SEQ ID NO:10
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15中的任一个或其补体具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一组一个或多个靶基因座或所述第二组一个或多个靶基因座包括白蛋白(ALB)基因座。14.根据权利要求13所述的方法，其中被配置成与所述第一组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列或被配置成与所述第二组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列与SEQ ID NO:17至19中的任一个或其补体具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第一组一个或多个靶基因座或所述第二组一个或多个靶基因座包括核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)基因座。16.根据权利要求15所述的方法，其中被配置成与所述第一组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列或被配置成与所述第二组一个或多个靶基因座杂交的所述间隔子序列与SEQ ID NO:16、20、21或22中的任一个或其补体具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其进一步包括将包括以下的供体DNA序列引入到所述细胞：编码异源工程化T细胞受体分子的开放阅读框、包括位于所述第一组一个或多个靶基因座的第一侧的DNA序列的第一同源臂和包括位于所述第一组一个或多个靶基因座的第二侧的DNA序列的第二同源臂。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中编辑包括插入插入和缺失(indel)、提前终止密码子、错义密码子、移码突变、腺嘌呤脱氨基化、胞嘧啶脱氨基化或其任何组合。19.一种制备糖皮质激素抵抗性工程化T细胞的方法，所述方法包括将以下引入到T细胞或其前体：(a)靶向T细胞受体(TCR)基因座的RNA引导的核酸内切酶复合物，所述RNA引导的核酸内切酶复合物包括：(i)第一RNA引导的核酸内切酶或编码所述第一RNA引导的核酸内切酶的DNA；以及(ii)第一工程化向导RNA，所述第一工程化向导RNA包括RNA序列，所述RNA序列被配置成与所述第一RNA引导的核酸内切酶形成复合物，以及第一间隔子序列，所述第一间隔子序列被配置成与所述TCR基因座的至少一部分杂交；以及(b)靶向T细胞受体核受体亚家族3C组成员1(NR3C1)基因座的RNA引导的核酸内切酶复合物，所述RNA引导的核酸内切酶复合物包括：(i)第二RNA引导的核酸内切酶；以及(ii)第二工程化向导RNA，所述第二工程化向导RNA包括：RNA序列，所述RNA序列被配置成与所述第二RNA引导的核酸内切酶形成复合物，以及第二间隔子序列，所述第二间隔子序列被配置成与所述NR3C1基因座的至少一部分杂交。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述TCR基因座的所述至少一部分位于所述T细胞基因座内。21.根据权利要求19至20中任一项所述的方法，其进一步包括将(b)包括以下的供体DNA序列引入到所述细胞：编码异源工程化T细胞受体分子的开放阅读框、包括位于所述靶序列的第一侧的DNA序列的第一同源臂和包括位于所述TCR基因座内的所述靶序列的第二
侧的DNA序列的第二同源臂。22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶或所述第二RNA引导的核酸内切酶包括2类II型Cas核酸内切酶或2类V型Cas核酸内切酶。23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶包括所述2类II型Cas核酸内切酶，并且所述第二RNA引导的核酸内切酶包括所述2类V型Cas核酸内切酶。24.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述第二RNA引导的核酸内切酶包括所述2类II型Cas核酸内切酶，并且所述第一RNA引导的核酸内切酶包括所述2类V型Cas核酸内切酶。25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述异源工程化T细胞受体是CAR分子。26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述T细胞受体基因座的所述至少一部分是T细胞受体α常数(TRAC)基因座或T细胞受体β常数(TRBC)基因座。27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述同源臂包括所述TCR基因座内的接近所述T细胞受体基因座的所述至少一部分的内含子区或外显子区。28.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述T细胞受体基因座的所述至少一部分是TRAC的第一外显子或第三外显子。29.根据权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述方法以至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的效率破坏所述TCR基因座和所述NR3C1基因座的基因组序列。30.根据权利要求28所述的方法，其中所述效率是针对从所述TCR基因座和所述NR3C1基因座表达的蛋白质通过流式细胞术测定的。31.根据权利要求19至30中任一项所述的方法，其中所述NR3C1基因座的所述至少一部分是外显子2或外显子3。32.根据权利要求19至31中任一项所述的方法，其中所述方法以至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更高的效率产生对CAR分子呈阳性并且对NR3C1呈阴性的细胞。33.根据权利要求19至32中任一项所述的方法，其包括将(a)至(c)同时引入到所述T细胞或其前体。34.根据权利要求19至33中任一项所述的方法，其中所述第一RNA引导的核酸内切酶或所述第二RNA引导的核酸内切酶包括与SEQ ID NO:1、4或7中的任一个具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。35.根据权利要求19至34中任一项所述的方法，其中所述第一工程化向导RNA或所述第二工程化向导RNA包括与SEQ ID NO:3、6或9中的任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩，
申请(专利权)人：宏基因组学公司，
类型：发明
国别省市：