小于380个氨基酸的超级迷你型基因编辑器及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及小于380个氨基酸的超级迷你型基因编辑器及其应用。该基因编辑器具有以下至少一种氨基酸序列：SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第1~379位、第1~378位、第1~377位、第1~376位、第1~375位的氨基酸序列。本发明专利技术首次开发了小于380个AA的超级迷你型基因编辑器，本发明专利技术的超级迷你型基因编辑器，可以高效实现从哺乳类动物细胞到活体动物的精准、高效编辑，具有极大的推广应用价值。价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
小于380个氨基酸的超级迷你型基因编辑器及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及小于380个氨基酸的超级迷你型基因编辑器及其应用。

技术介绍

[0002]基因编辑技术是指对基因进行靶向修饰（敲除、插入、替换等）而获得新的特征或功能的技术，从第一代DNA核酸酶编辑系统ZFNs、第二代TALENs到第三代CRISPR/Cas9系统，以及以CRISPR/Cas9为基础的BE（Base editing）系统和PE（Prime editing）系统，基因编辑效率不断提高、编辑类型不断丰富，成本逐渐降低，应用范围不断扩大，已经深入广泛地用于了医疗、农业、能源、材料与环境等领域，并已经有不少的相关基因编辑产品上市，而更多的产品正在临床试验或者上市前准备之中。特别重要的是，基因编辑为人体细胞或组织及其他生命体的遗传改造和基因治疗提供了前所未有的强大工具，这将为整个生物产业带来巨大的革命性发展机遇。
[0003]早期研究发现，CRISPR/Cas9系统来源于细菌和古细菌的天然获得性免疫系统，通过CRISPR RNA (crRNA)和trans
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activating crRNA (tracrRNA)以及Cas9蛋白组成的复合体抵御外源性DNA的入侵。2012年CRISPR/Cas9的体外重构和2013年在人类细胞中证明了其基因编辑功能，标志着新一代基因编辑时代的开始，随后此技术成功的在不同类型的细胞及动植物多个物种中行使基因编辑功能。但CRISPR/Cas9与ZFNs和TALENs一样，都是在基因组靶标位点引起DNA双链断裂，进而激活细胞内部修复机制的基础上实现编辑的。细胞内DNA双链断裂的修复机制包括易引起随机插入、缺失的异源末端连接和需要同源模板存在才可以激活的同源重组修复。但是异源末端连接容易引起随机插入，进而影响靶基因的功能及基因组稳定性；同源重组（HDR）尽管精确性高于末端连接（NHEJ），但是其在细胞中的同源重组修复效率低，约为0.1%~5%，这些都大大限制了精确基因编辑技术的应用。随后针对上述缺陷，2016年4月，美国哈佛大学David Liu实验室开发了不需要依赖DNA双链断裂即可进行单碱基转换的基因编辑技术——BE技术。该技术基于无核酸酶活性的dCas9 (Inactive or dead Cas9) 或有单链DNA切口酶活性的Cas9n (Cas9 nickase)、胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制子(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI) 以及sgRNA形成的复合体，在不引起双链DNA断裂的情况下，直接使靶向位点的胞嘧啶(Cytosine, C)脱氨基变成尿嘧啶(Uracil, U)；由于尿嘧啶糖基化酶抑制子的存在，抑制了U的切除；随着DNA复制，U被胸腺嘧啶(Thymine, T)取代；同时，互补链上原来与C互补的鸟嘌呤(Guanine, G)将会替换为腺嘌呤(Adenine, A)，最终实现了在一定的活性窗口内C
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T和G
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A的单碱基精准编辑。随后2017年，基于E. coli TadA (ecTadA)的新型单碱基编辑器——腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABEs)，实现了A.T碱基对向G.C碱基对的转换。随后国内外科学家又对BE技术进行扩展，陆续开发了GCBE及双BE等编辑器，并且上述各种BE编辑器在不同类型细胞及不同的动植物物种都成功应用。但是这些研究主要用于部分类型的单碱基突变，不能实现其他类型的精确突变，比如任意类型的点突变，精确的删除和插入等等。
2019年，David R. Liu实验室开发了PE（Prime editing）编辑系统，该系统不仅可以引入插入和缺失（indels），还可以实现12种碱基之间的任意转换。该系统的工作原理是：sgRNA被改造成pegRNA（prime editing guide RNA），pegRNA包含引物结合位点(primer binding site, PBS)区域；还携带着逆转录的模板序列，可以和逆转录酶（RT）相结合，而pegRNA序列引导将其带入到目标基因序列中实现基因编辑。随后国内外课题组对PE细胞进行各方面优化，比如提高效率，删除和插入的片段增大等等，而且此技术成功在各种常用的细胞，小鼠，斑马鱼等模型动物以及许多植物中成功应用，但目前在原代细胞中编辑效率很低，而且在大动物的细胞和个体水平都未有成功报道，更重要的是PE系统与BE系统类似，都因为其自身体量过大，从而限制其在AAV基因治疗系统中广泛应用，而这恰是人类基因治疗的核心关键所在。
[0004]针对上述Cas9，以及基于其发展的BE系统和PE系统，显著弱点是元件过大，造成细胞转染或者投递效率低，从而限制了其应用范围，特别重要的是由于编辑器分子量巨大，远远超过AAV基因治疗系统的承载量(小于4.7kb)，因此限制了上述这些基因编辑作为药物或者治疗手段以及体内外细胞遗传修饰的应用。当前编辑器过大的原因主要是Cas9这个底盘核心工具分子量过大，达到了1368个氨基酸之多，以此为基础融合其他功能域（domain）构建的BE和PE系统进一步增大分子量，而这个问题不可能从底盘解决。因此国内外多个课题组，开始通过寻找新的底盘Cas系统的小型酶，以发展新的编辑工具。目前主要有CasMINI (557AA)、AsCas12f1 (422AA)、OgeuIscB (499AA)和SpCas12f (497AA)，但是其效率远低于Cas9 (平均只有2%左右)，且很多研究仅限于细胞水平，很少扩展到动植物研究及基因治疗研究。同时这些小型酶虽然比Cas9酶(1368AA)小，但还不足以小到可以融合不同domain以用于未来各种应用，重要的是截至目前为止，全球还未有小于380个AA的新型编辑器的报道。
[0005]2021年nature报道发现了一个新的小型的TnpB编辑工具，认为是Cas12系统的祖先，而且仅有408个AA，但此报道仅仅在293T细胞中做了靶点的验证，截至目前，尚未见到此编辑工具在其他类型细胞和动物水平的研究报道。2023年王皓毅等人在nature上又报道了从64个注释的IS605成员中筛选获得的25个在大肠杆菌中活跃的TnpBs，通过进一步研究后获得369个氨基酸和382个氨基酸的编辑器ISAam1和ISYmu1，但是该基因编辑器的长度仍然较长。
[0006]因此，开发出更小且效率高的基因编辑器，仍然是当前基因编辑研发领域的核心关键任务。

技术实现思路

[0007]本专利技术通过对TnpB编辑器进行功能域精简的工程化操作，系统开发了小于380个AA的超级迷你型编辑器，命名为SuperMini
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GE
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SWL，并且经过验证发现其在不同类型的哺乳细胞中可以实现高效的基因编辑，效率在10%
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60%中间，平均达到了20.74%，远远高于原始TnpB及其他小型基因编辑器。同时，本专利技术将超级迷你型基因编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑器，其特征在于，其具有以下至少一种氨基酸序列：SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第1~379位、第1~378位、第1~377位、第1~376位、第1~375位的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的基因编辑器，其特征在于，其包括权利要求1中至少一种所述的氨基酸序列以及功能蛋白；或其包括权利要求1中至少一种所述的氨基酸序列以及多肽；所述功能蛋白或多肽选自以下至少一种：表位标签、报告基因序列、核定位信号序列、穿膜肽、靶向部分、转录激活结构域、转录抑制结构域、核酸酶结构域、具有下列活性的结构域：核苷酸脱氨酶、甲基化酶活性、去甲基化酶、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、单链RNA切割活性、双链RNA切割活性、单链DNA切割活性、双链DNA切割活性、核酸结合活性。3.编码权利要求1或2所述基因编辑器的核酸。4.一种复合物，其特征在于，包括蛋白组分和核酸组分；所述蛋白组分为权利要求1或2所述的基因编辑器；所述核酸组分中含有TTGAT/TTTAT特征以及能够与靶序列杂交的导向序列；和/或，所述核酸组分中含有导向RNA的核苷酸序列。5.一种生物材料，其特征在于，其中含有权利要求1或2所述的基因编辑器、或权利要求3所述的核酸、或权利要求4所述的复合物；所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，孙照霖，李宁，
申请(专利权)人：北京科芙兰德生物科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：