经分离的Cas13蛋白、基于它的基因编辑系统及其用途技术方案

本申请涉及经分离的新型CRISPR/Cas13蛋白，基于它的基因编辑系统以及使用它们进行RNA水平基因编辑的方法。本申请提供了非天然存在或经工程化改造的RNA靶向系统，这些系统含有一个靶向RNA的新型Cas13效应蛋白，以及至少一种向导分子。少一种向导分子。

【技术实现步骤摘要】
经分离的Cas13蛋白、基于它的基因编辑系统及其用途


[0001]本申请为生物
，具体涉及经分离的Cas13蛋白，基于它的基因编辑系统以及使用它们进行RNA水平基因编辑的方法。

技术介绍

[0002]基因编辑(gene editing)技术使得DNA序列定位点进行改造成为可能，比如第一代基因编辑工具锌指核酸酶(zinc fingernucleases,ZFNs)，第二代基因编辑工具类似转录激活的小型核酸酶(transcription activator
‑
like effector nucleases,TALENs)，第三代基因编辑工具中的II型及V型的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR,Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas(CRISPR
‑
associated protein)都可以用于靶向改造基因组，但这些基因编辑系统只能靶向基因组及外来的DNA，而不能对体内RNA进行靶向编辑。
[0003]VI型的CRISPR/Cas13系统，是来自古生菌和细菌的天然免疫系统。其不同于以往基因编辑工具，利用核酸碱基互补配对原理进行目标RNA序列的识别，引导Cas效应蛋白进行靶向切割，适用性强、设计简单、效率高。
[0004]其中，VI
‑
D型CRISPR/Cas13基因编辑系统是现下应用较为广泛的VI型CRISPR/Cas系统。这一系统在原核生物中可通过识别并切割靶向的多核苷酸上双侧的原间隔序列侧翼位点(Protospacer flanking site,PFS)序列，从而对单链RNA进行靶向编辑，而在真核生物中，VI
‑
D型CRISPR/Cas系统对RNA的靶向编辑作用无PFS序列。同时相比于其他VI型系统，VI
‑
D型系统具有更小的蛋白体积，在基于腺相关病毒(Adeno
‑
associatedvirus,AAV)的基因治疗具有更好的前景。在庞大以及各色各样的宏基因组中，隐藏了尚未培养甚至尚未发现的微生物，可能存在大量的未被发现的VI型CRISPR/Cas13系统，在这些微生物中寻找和克隆获得更具优良特性的Cas蛋白是人们所期望的。

技术实现思路

[0005]本申请的目的就是在宏基因组中寻找新型Cas13基因编辑系统并开发其用途。具体地提供了：
[0006]1.经分离的Cas13核酸酶蛋白，所述Cas13蛋白的氨基酸序列包括：
[0007]a)如SEQ ID NO.1～28中任一项所示的氨基酸序列；或，
[0008]b)与SEQ ID NO.1～28中的任一项具有至少80％序列同一性、且具有RNA切割活性的氨基酸序列。
[0009]2.如项2所述的Cas13核酸酶蛋白，其中所述Cas13蛋白是Cas13bt1、Cas13bt2、Cas13g、Cas13h、Cas13i、Cas13j或Cas13k蛋白。
[0010]3.一种工程化的Cas13核酸酶效应蛋白，包含:
[0011]a)如SEQ ID NO.1～28中任一项所示的氨基酸序列；或，
[0012]b)与SEQ ID NO.1～28中的任一项具有80％以上序列同一性、且具有RNA切割活性
的氨基酸序列。
[0013]4.项3的效应蛋白，其中所述Cas13核酸酶效应蛋白通过氨基酸突变失去催化活性，例如所述Cas13核酸酶蛋白在其C端、N端的HEPN结构域(RxxxxH基序)进行突变形成dCas13蛋白。
[0014]5.项3或4所述的效应蛋白，其还包含与所述Cas13核酸酶蛋白融合的功能结构域。
[0015]6.项5所述的效应蛋白，所述功能结构域选自如下的一项或多项：翻译起始结构域、翻译阻遏结构域、反式激活结构域、表观遗传修饰结构域、核碱基编辑结构域、逆转录酶结构域、报告分子结构域和核酸酶结构域。
[0016]7.项6所述的效应蛋白，其中所述核碱基编辑结构域为腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶或所述它们的催化结构域融合。
[0017]8.一种多核苷酸，其编码项1或2的Cas13核酸酶蛋白或项3
‑
7任一项的效应蛋白。
[0018]9.包含如项8所述的多核苷酸的载体，优选所述载体为质粒或慢病毒。
[0019]10.一种工程化的CRISPR
‑
Cas13基因编辑系统，包含：
[0020](a)项3
‑
7中任一项所述的工程化Cas13核酸酶效应蛋白或编码所述效应蛋白的核酸；以及
[0021](b)crRNA，其包含与靶序列互补的间隔区序列，当分别使用如SEQ ID NO.1～28所示的工程化Cas13核酸酶效应蛋白时所述crRNA还分别包含与SEQ ID NO.29～56所示的序列具有至少80％同一性的直接重复(directrepeat,DR)序列；
[0022]其中所述工程化的Cas13核酸酶效应蛋白和所述crRNA能够形成CRISPR复合物，所述CRISPR复合物特异性结合包含所述靶序列的靶核酸并诱导所述靶核酸的修饰。
[0023]11.包含如项10所述的工程化的CRISPR
‑
Cas13基因编辑系统的试剂盒。
[0024]12.如项3
‑
7任一项所述的工程化的CRISPR
‑
Cas13核酸酶效应蛋白、项10的工程化的CRISPR
‑
Cas13基因编辑系统在制备治疗与个体的细胞中与核酸突变相关的疾病或病症的药物中的用途。
[0025]13.一种修饰细胞中包含的靶核酸的方法，包括使所述细胞与项3
‑
7任一项所述的工程化的CRISPR
‑
Cas13核酸酶蛋白效应蛋白、项10的工程化的CRISPR
‑
Cas13基因编辑系统接触从而实现对细胞中所述靶核酸的修饰。
[0026]14.如项3
‑
7任一项所述的工程化的CRISPR
‑
Cas13核酸酶效应蛋白或项10的工程化的CRISPR
‑
Cas13基因编辑系统的用于制备用来治疗个体中与核酸突变相关的疾病或病症的药物的用途。
[0027]本申请还提供了：
[0028]1.经分离的Cas13核酸酶蛋白，所述Cas13核酸酶蛋白的氨基酸序列为：
[0029]a)如SEQ ID NO.1～28中任一序列所示的氨基酸序列；或，
[0030]b)与SEQ ID NO.1～28中的任一序列具有至少80％的序列同一性、且具有RNA切割活性的氨基酸序列。
[0031]2.如项1所述的Cas13核酸酶蛋白，其中所述Cas13核酸酶蛋白是Cas13bt1、Cas13bt2、Cas13g、Cas13h、Cas13i、Cas1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.经分离的Cas13核酸酶蛋白，所述Cas13核酸酶蛋白的氨基酸序列为：a)如SEQ ID NO.1～28中任一序列所示的氨基酸序列；或b)与SEQ ID NO.1～28中的任一序列具有至少80％的序列同一性、且具有RNA切割活性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的Cas13核酸酶蛋白，其中所述Cas13核酸酶蛋白是Cas13bt1、Cas13bt2、Cas13g、Cas13h、Cas13i、Cas13j或Cas13k蛋白，优选为Cas13g3。3.一种工程化的Cas13核酸酶效应蛋白，包含Cas13核酸酶蛋白，该Cas13核酸酶蛋白包含:a)如SEQ ID NO.1～28中任一序列所示的氨基酸序列；或，b)与SEQ ID NO.1～28中的任一序列具有80％以上序列同一性、且具有RNA切割活性的氨基酸序列。4.如权利要求3的所述效应蛋白，其中所述Cas13核酸酶蛋白通过氨基酸突变失去催化活性，例如所述Cas13核酸酶蛋白在其C端和/或N端的HEPN结构域(RxxxxH基序)通过氨基酸突变形成dCas13蛋白。5.权利要求3或4所述的效应蛋白，其还包含与所述Cas13核酸酶蛋白融合的功能结构域。6.如权利要求5所述的效应蛋白，所述功能结构域选自如下的一项或多项：翻译起始结构域、翻译阻遏结构域、反式激活结构域、表观遗传修饰结构域、核碱基编辑结构域、逆转录酶结构域、报告分子结构域和核酸酶结构域。7.如权利要求6所述的效应蛋白，其中所述核碱基编辑结构域为腺苷脱氨酶、胞苷脱氨酶或它们的催化结构域。8.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2的Cas13核酸酶蛋白或权利要求3
‑
7任一项的效应蛋白。9.包含如权利要求8所述的多核苷酸的载体，所述载体为质粒或病毒，所述病毒优选为慢病毒。10.一种工程化的CRISPR
‑
Cas13基因编辑系统，包含：(a)如权利要求1或2所述的核酸酶、如权利要求3
‑
7中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，周琪，胡艳萍，陈阳灿，
申请(专利权)人：北京干细胞与再生医学研究院，
类型：发明
国别省市：