分裂的制造技术

本申请提供了工程化的分裂

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分裂的CAS12系统及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于
2020
年8月
25
日提交的国际专利申请
PCT/CN2020/111057
的优先权，其内容通过引用整体并入本文
。
[0003]ASCII
文本文件序列表的提交
[0004]以下提交的
ASCII
文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式
(CRF)(
文件名：
182452000441SEQLIST.txt
，记录日期：
2021
年8月
23
日，大小：
156KB)。


[0005]本申请总体上涉及生物

。
更具体地，本申请涉及工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统
。

技术介绍

[0006]基因组编辑是基因组研究和各种应用中的一项重要且有用的技术
。
各种系统可用于基因组编辑，包括成簇规则间隔短回文重复
(CRISPR)
‑
Cas
系统
、
转录激活因子样效应核酸酶
(TALEN)
系统和锌指核酸酶
(ZFN)
系统
。
[0007]CRISPR
‑
Cas
系统是一种高效且低成本的基因组编辑技术，广泛适用于从酵母和植物到斑马鱼和人类的一系列真核生物
(
参见综述
Van der Oost 2013
，
Science 339
：
768
‑
770
和
Charpentier and Doudna
，
2013
，
Nature 495
：
50
‑
51)。CRISPR
‑
Cas
系统通过结合使用
Cas
效应蛋白和
CRISPR RNAs(crRNAs)
，在古生菌和细菌中提供适应性免疫
。
迄今为止，根据该系统突出的功能和进化模块性，已经对包括六种类型
(I
‑
VI
型
)
的
CRISPR
‑
Cas
系统的两类
(1
类和2类
)
进行了表征
。
在2类
CRISPR
‑
Cas
系统中，
II
型
Cas9
系统和
V
‑
A
型
Cas12a/Cpf1
系统已被用于基因组编辑，并为生物医学研究带来巨大希望
。
[0008]然而，当前的
CRISPR
‑
Cas
系统存在各种局限性
。
例如，它们可能在效率
、
易用性
、
稳定性
、
特异性等方面受到限制
。
因此，需要改进的方法和系统来进行有效的基因组编辑
。
[0009]专利技术概述
[0010]为了解决上述和其他需求，本申请提供了包含分裂的
Cas12b
多肽的工程化
CRISPR
‑
Cas
系统及其使用方法
。
[0011]在一个方面，本申请提供了一种工程化的成簇规则间隔短回文重复
(CRISPR)
‑
CRISPR
相关
(Cas)(CRISPR
‑
Cas)
系统，其包含：
(a)
包含参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分的第一多肽，
(b)
包含参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分的第二多肽，和
(c)
包含指导序列的指导
RNA
；其中参考
Cas12b
蛋白从
N
端到
C
端包含：第一
WED
结构域
(WED
‑
I)、
第一
REC
结构域
(REC1)、
第二
WED
结构域
(WED
‑
II)、
第一
RuvC
结构域
(RuvC
‑
I)、BH
结构域
、
第二
REC
结构域
(REC2)、
第二
RuvC
结构域
(RuvC
‑
II)、
第一
Nuc
结构域
(Nuc
‑
I)、
第三
RuvC
结构域
(RuvC
‑
III)
和第二
Nuc
结构域
(Nuc
‑
II)
，其中参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含参考
Cas12b
蛋白的
WED
‑
I、REC1
和
WED
‑
II
结构域；其中参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含参考
Cas12b
蛋白的
RuvC
‑
II、Nuc
‑
I、RuvC
‑
III
和
Nuc
‑
II
结构域；其中参考
Cas12b
蛋白的
RuvC
‑
I、BH
和
REC2
结构域在参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分和参
考
Cas12b
蛋白的
C
端部分之间裂开；并且其中第一多肽
、
第二多肽和指导
RNA
能够彼此缔合以形成
CRIPSR
复合物，该复合物特异性结合包含与所述指导序列互补的靶序列的靶核酸
。
在一些实施方案中，其中参考
Cas12b
蛋白具有
N
个氨基酸残基；第一多肽包含参考
Cas12b
蛋白的第1‑
X
位氨基酸残基，其中
X
为大于1且小于
N
的整数；第二多肽包含参考
Cas12b<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】kakegawensis)
的
Cas12b(AkCas12b)、
来自大孢脂环酸芽孢杆菌
(Alicyclobacillus macrosporangiidus)
的
Cas12b(AmCas12b)、
来自外村尚芽孢杆菌
(Bacillus hisashii)
的
Cas12b(BhCas12b)、
来自芽孢杆菌属
(Bacillus)
的
BsCas12b、
来自芽孢杆菌
V3
‑
13(Bacillus sp.V3
‑
13)
的
Cas12b(Bs3Cas12b)、
来自非常脱硫弧菌
(Desulfovibrio inopinatus)
的
Cas12b(DiCas12b)、
来自沉积物莱西氏菌
(Laceyella sediminis)
的
Cas12b(LsCas12b)、
来自螺旋体细菌
(Spirochaetes bacterium)
的
Cas12b(SbCas12b)、
来自热生肿块芽胞杆菌
(Tuberibacillus calidus)
的
Cas12b(TcCas12b)
及其功能衍生物
。8.
根据权利要求7所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白是来自嗜酸脂环酸芽孢杆菌
(AaCas12b)
的
Cas12b
蛋白或其功能衍生物
。9.
根据权利要求8所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第1‑
658
位氨基酸残基，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第
659
‑
1129
位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号是根据
SEQ ID NO:33。10.
根据权利要求9所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含与
SEQ ID NO:3
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含与
SEQ ID NO:4
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列
。11.
根据权利要求8所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第1‑
783
位氨基酸残基，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第
784
至
1129
位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号是根据
SEQ ID NO:33。12.
根据权利要求
11
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含与
SEQ ID NO:5
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含与
SEQ ID NO:6
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列
。13.
根据权利要求8所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第1‑
518
位氨基酸残基，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第
519
‑
1129
位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号是根据
SEQ ID NO:33。14.
根据权利要求
13
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含与
SEQ ID NO:1
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含与
SEQ ID NO:2
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列
。15.
根据权利要求7所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白是来自芽孢杆菌
V3
‑
13
的
Cas12b
蛋白
(Bs3Cas12b)
或其功能衍生物
。16.
根据权利要求
15
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第1‑
650
位氨基酸残基，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含参考
Cas12b
蛋白的第
651
‑
1112
位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号是根据
SEQ ID NO:85。
17.
根据权利要求
16
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含与
SEQ ID NO:83
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含与
SEQ ID NO:84
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列
。18.
根据权利要求7所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白是来自热生肿块芽胞杆菌的
Cas12b
蛋白
(TcCas12b)
或其功能衍生物
。19.
根据权利要求
18
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含所述参考
Cas12b
蛋白的第1‑
671
位氨基酸残基，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含参考
Cas12b
蛋白的第
672
‑
1142
位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号是根据
SEQ ID NO:88。20.
根据权利要求
19
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述参考
Cas12b
蛋白的
N
端部分包含与
SEQ ID NO:86
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述参考
Cas12b
蛋白的
C
端部分包含与
SEQ ID NO:87
的氨基酸序列具有至少
85
％序列同一性的氨基酸序列
。21.
根据权利要求1‑
20
中任一项所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中第一多肽和第二多肽不包含二聚化结构域
。22.
根据权利要求1‑
10
中任一项所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述第一多肽包含第一二聚化结构域，并且所述第二多肽包含第二二聚化结构域
。23.
根据权利要求
22
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述第一二聚化结构域和所述第二二聚化结构域在诱导剂存在下彼此缔合
。24.
根据权利要求
23
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述第一二聚化结构域是
FK506
结合蛋白
(FKBP)
并且所述第二二聚化结构域是
FKBP
‑
雷帕霉素结合结构域
(FRB)
，或者所述第一二聚化结构域是
FRB
并且所述第二二聚化结构域是
FKBP
，以及诱导剂是雷帕霉素
。25.
根据权利要求1‑
24
中任一项所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述指导
RNA
是单链指导
RNA(sgRNA)
，所述
sgRNA
包含反式激活
CRISPR RNA(tracrRNA)
序列和含有所述指导序列的
CRISPR RNA(crRNA)
序列，并且其中
sgRNA
从
5'
到
3'
包含：第一茎环
、
第二茎环
、
第三茎环和第四茎环
。26.
根据权利要求
25
所述的工程化的
CRISPR
‑
Cas
系统，其中所述
sgRNA
包含
S...

【专利技术属性】
技术研发人员：周琪，李伟，滕飞，高情琴，
申请(专利权)人：北京干细胞与再生医学研究院，
类型：发明
国别省市：