一种细胞毒活性高的人胰核糖核酸酶突变体hRNase-mult及其编码基因制造技术

本发明专利技术公开了蛋白质工程改造的高活力人胰核糖核酸酶(hRNase)，属于生物工程技术领域。本发明专利技术公开了一种利用蛋白质工程改造人胰核糖核酸酶，通过人胰核糖核酸酶多聚化、优化活性中心而得到的人胰核糖核酸酶突变体。进而获得一种对核糖核酸酶抑制剂高度抗性的人胰核糖核酸酶多聚突变体(hRNase

【技术实现步骤摘要】
一种细胞毒活性高的人胰核糖核酸酶突变体hRNase
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mult及其编码基因


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程领域，通过氨基酸取代设计得到了细胞毒活性极大提高的人胰核糖核酸酶突变体hRNase
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mult。

技术介绍

[0002]RNase是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶，除了水解RNA的活性外，很多RNase具有潜在的细胞毒性。RNase能广泛参与RNA代谢、细胞成熟、细胞凋亡、血管生成以及宿主防御RNA病毒等过程。其中RNase A家族具有抗病毒和抗肿瘤等特殊的生物学功能，在疾病的诊断和治疗方面表现出重要的应用价值，尤其是抗肿瘤功能，为临床治疗肿瘤提供了新的前景，成为目前研究的一大热点。
[0003]RNase A家族广泛分布在脊椎动物中，都具有细胞毒性和抗肿瘤活性，它们具有很高的序列相似性，几乎每个成员都含有由八个半胱氨酸组成的四个二硫键，在编码序列的前端都有一段信号肽，成熟的RNase的氨基酸序列中均含有非常保守的CKXXNTF序列特征元件(XX为任意氨基酸)。
[0004]核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是一种存在于哺乳动物细胞浆中的酸性糖蛋白，分子量约为50kDa。RI与RNaseA超家族成员能紧密亲和，形成马蹄形的立体结构，阻止其攻击和破坏细胞中的RNA，从而导致核糖核酸酶的活性受到抑制。
[0005]RNase A具有细胞毒性，能够抑制肿瘤细胞的生长，它是第一个被应用于动物肿瘤和临床白血病治疗的RNase，并取得一定的效果。但是由于它的细胞毒性较弱，因此在抗肿瘤方面存在一定的缺陷和不足。近年来的研究表明，化学修饰能明显提高RNase A的抗肿瘤活性。经过化学修饰后，RNase A的变异体与RI之间的亲和力明显减小。
[0006]牛精液核糖核酸酶(bovine seminal ribonuclease,BS
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RNase)存在于牛精液中，也属于RNase A超家族中的一员。BS
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RNase是RNase A超家族中唯一的一个天然二聚体RNase。与RNase A相比，仅24位氨基酸残基不同，但是具有不同的酶活性和细胞毒性。它不仅能影响肿瘤细胞还能显示出胚胎中毒、精子生成缺乏以及免疫抑制力活性等性质。
[0007]细胞毒性RNase在肿瘤治疗中已显示出诱人的前景，有望成为新的抗肿瘤药物。在临床试验中，有的RNase如ONC虽然具有很好的抗肿瘤效果，但其在肿瘤治疗过程中还具有明显的副作用。因此，减少细胞毒性RNase的毒副作用和提高其抗肿瘤的有效性是目前研究的重点，这需要我们进一步研究出新的途径来解决这些问题。我们可以通过基因工程等方法对细胞毒性RNase进行人工改造，减少其对人体正常细胞的毒性，使其对肿瘤细胞的靶向性增强，从而增强抗肿瘤效果。另外，细胞毒性RNase的抗肿瘤机制目前尚不明确，进一步研究其抗肿瘤机制有助于我们设计出更高效、特异、安全的用于临床治疗的核糖核酸酶。RNase A在治疗肿瘤中显示出诱人的前景，并有望成为新的抗肿瘤药物，然而RNase A和BS
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RNase均在使用过程中产生了明显的免疫原性。本专利技术采用人胰RNase(hRNase)研究其结构功能，并进行多聚化，将有助于研制和开发出具有应用价值的高效低毒抗肿瘤新药。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是通过对人胰核糖核酸酶hRNase进行分子改造，使改造后的hRNase形成二聚体以上的多聚体，降低核糖核酸酶抑制因子RI对人胰核糖核酸酶突变体hRNase
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mult的抑制作用，从而极大地提高hRNase
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mult对肿瘤细胞的细胞毒性。
[0009]突变体hRNase
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mult起码包含的突变位点Q28L、R31C、R32C、G38K、K39G、N71A、G88R、E111A。突变体HRNase
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mult在SDS
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PAGE上显示二聚体、四聚体等多具体形式，而人胰核糖核酸酶hRNase仅为单体形式。相对于人胰核糖核酸酶hRNase，突变体hRNase
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mult对肿瘤细胞的细胞毒活性提高了10
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500倍。因此，本专利技术获得的人胰核糖核酸酶突变体hRNase
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mult具有良好的形成多聚体能力，极大降低核糖核酸酶抑制因子RI对人胰核糖核酸酶突变体hRNase
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mult的抑制作用，为其在医药健康领域应用奠定基础。
[0010]一种获得上述高细胞毒活性的人胰核糖核酸酶突变体hRNase
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mult的突变方法，其包括如下步骤:
[0011]1)人胰hRNase基因合成及克隆：将己公布的人胰核糖核酸酶hRNase基因，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成得到合成基因，然后以合成基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pGAPZa A上，得到重组载体pGAPZa A
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hRNase；
[0012]2)人胰hRNase
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mult基因合成及克隆：将上步骤的人胰核糖核酸酶hRNase基因按照Q28L、R31C、R32C、G38K、K39G、N71A、G88R、E111A进行突变，按照毕赤酵母密码子偏好性进行合成得到合成基因，将得到的片段克隆到载体pGAPZa A上，得到重组载体pGAPZa A
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hRNase
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mult；
[0013]相对于人胰核糖核酸酶hRNase，突变体hRNase
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mult细胞毒活性升高10
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500倍。因此，本专利技术的获得的人胰核糖核酸酶突变体hRNase
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mult具有良好的细胞毒活性，为其在健康领域应用奠定基础。
[0014]本专利技术具有如下有益效果：
[0015]与现有技术相比，该带有照明功能的换药车，设置的玻璃板、按钮、卡扣、卡槽、弹簧和阻尼杆，可以使照明灯固定在上端，实现向外照明的功能，防止发生磕碰等意外，设置的固定杆、阻尼环、转动环和阻尼块，可以使照明灯向储存箱内照明，使医护人员使用和收回物品时更方便安全，这样的设计可以节约能源、物资，节约用电，并且大大的提高的医护人员推车时的安全性，同时也可以警示过往的患者；
[0016]与现有技术相比，该带有照明功能的换药车，设置的灯罩、阻尼板，可以使照明灯向内照射时，减小光的强度，改变光的颜色，使得光线不会那么刺眼，提高医护人员的使用体验，可以提高工作效率，同时阻尼板的设计可以使灯罩安装更牢固，同时也方便安装和拆卸。
附图说明
[0017]图1为本专利技术GS115表达的hRNase
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mult，1、2、3、4、5为重组子，M为分
[0018]子量标准示意图；
具体实施方式
[0019]以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞毒活性提高的hRNase
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mult，其包含人胰核糖核酸酶亲本的突变体，其中所述变体来自基序(SEQ ID NO：1)，其中所述突变体与SEQ ID NO 1相比包含一个或多个替换，其中所述替换如下：K1M、K1R、K1V、K1Y、R4K、R4M、A5F、A5G、K6Q、K6G、K7D、K7T、F8V、Q9K、Q9S、Q9V、Q9L、Q9F、R10D、R10M、Q11V、Q11L、Q11K、H12S、Q12E、M13Y、M13Q、M13R、S13N、D14M、S15R、S15V、D16S、S17C、S18V、S19T、P19K、P19L、S20T、S20I、S20V、Q28L、M29W、M30S、M30D、M30T、R31C、R32C、R33C、N34D、N34E、N34T、N34S、N34A、M35H、T36C、T36V、Q37R、Q37S、G38D、G38E、G38N、S42C、V43L、V43M、V43F、V43W、N44D、N44E、N44T、N44S、N44A、T45D、T45E、T45A、T45C、V47G、V47L、V47C、V47K、V54G、V54L、V54C、V54K、Q55R、Q55S、N56D、V57G、V57L、V57C、V57K、F59Y、Q60R、Q60S、E61N、E61D、E61Q、K62S、K62L、K62F、K62R、V63G、V63L、V63C、V63K、T64N、T64Y、T64W、T64R、K66C、K66R、K66H、K66S、K66M、K66E、K66A、K66D、N67D、N67E、N67T、N67S、N67A、G68Q、G68D、G68M、G68R、G68A、G68S、G68E、G68L、G68K、G68V、G68H、Q69R、Q69S、G70Q、G70D、G70M、G70R、G70A、G70S、G70E、G70L、G70K、G70V、G70H、N71D、N71E、N71T、N71A、N71Q、C72S、Y73M、Y73C、Y73K、Y73G、Y73A、Y73S、Y73V、Y73D、Y73Q、Y73F、Y73L、Y73N、Y73I、Y73E、Y73T、K74L、K74C、K74R、K74H、K74S、K74M、K74E、K74A、K74D、S75W、S75F、S75H、S75C、S75P、S75V、S75R、S7T5、N76D、S77C、S77T、S77L、S77Q、S77V、S77K、S77R、S77M、S77I、S77H、S78C、S78T、S78L、M79H、H80S、I81L、T82D、T825E、T82A、T82C、D83E、R85K、L86I、T87 C、T87V、N88D、N88E、N88T、N88S、N88A、G89A、G89V、S90Q、S90H、S90L、S90P、S90E、R91K、Y92A、Y92S、Y92V、Y92D、Y92Q、Y92F、N94 D、N94E、N94T、N94S、N94A、A96G、A96V、Y97F、Y97L、Y97N、Y97I、Y97E、R98K、T99D、T99E、T99A、T99C、S100T、S100I、S100V、K102R、E103L、E103T、E103D、R104D、H105S、I106L、I107L、V108G、V108L、V108E、V108A、A109G、A109D、A109I、A109L、E111L、E111T、E111D、G112V、G112I、G112L、G112A、S113Q、S113H、S113L、S113E、Y115C、Y115K、Y115G...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙妙囡，孙德军，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：