用于治疗先天性肌营养不良的治疗性LAMA2载荷制造技术

本发明专利技术涉及一种组合物，所述组合物包含a)第一蛋白或编码所述第一蛋白的核酸构建体，所述第一蛋白包含能够结合和切割靶核酸序列的位点特异性DNA结合蛋白或由其组成；b)第二蛋白或编码所述第二蛋白的核酸构建体，所述第二蛋白包含转座酶或由转座酶组成；以及c)包含编码层粘连蛋白

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗先天性肌营养不良的治疗性LAMA2载荷


[0001]本专利技术涉及一种组合物及其治疗用途，特别是用于治疗先天性肌营养不良的用途，所述组合物包含含有与转座酶融合的位点特异性DNA结合蛋白的融合蛋白和LAMA2转基因，以将LAMA2转基因整合到细胞基因组内的特定位点。

技术介绍

[0002]先天性肌营养不良(CMD)是一类严重的早发型肌营养不良，其影响骨骼肌/心肌以及中枢神经系统。
[0003]在CMD中，层粘连蛋白α2链缺陷型先天性肌营养不良(laminin
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α2chain
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deficient co
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genital muscular dystrophy，LAMA2 MD)，也称为分区蛋白缺陷型先天性营养不良1A型(merosin
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deficient congenital dystrophy type 1A，MDC1A)，其特征在于严重的张力减退、肌无力、骨骼畸形、不能移动和呼吸功能不全。该疾病有一些较晚发作的较轻微形式，其具有相似的症状但具有较广泛的表型变异性。
[0004]目前对于MDC1A没有可用的治愈方法。目前临床策略集中在管理上(补充进食，针对对呼吸功能不全的非侵入性通气支持，以及针对关节挛缩、脊柱缺损和其它问题的物理治疗)(Nguyen等人,2019.Appl Clin Genet.12:113
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130)。
[0005]MDC1A是由两个拷贝的LAMA2基因中均存在的功能丧失性隐性突变引起的，所述LAMA2基因编码层粘连蛋白α2链，这是层粘连蛋白
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211的一个亚基。层粘连蛋白
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211是一种细胞外基质蛋白，功能是在收缩期间稳定基底膜和肌肉纤维。层粘连蛋白α2链蛋白的长度为3122个氨基酸残基，因此其DNA编码序列(CDS)的长度为约9.3kb。与许多其它肌营养不良一样，MDC1A因此是由非常大的基因中的突变引起的，该基因大小超过了AAV载体或慢病毒载体的载货(cargo)容量。此外，迄今为止，在整个LAMA2基因中已描述了几十种不同的突变，从单点错义、剪接位点或框内突变到数千碱基区域缺失(Oliveira等人,2018.Hum Mutat.39(10):1314
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1337)，如此多以致于有疗效的基因治疗方法面临挑战，而基因置换策略迄今为止尚不可用。
[0006]已经对MDC1A测试了其它基于基因纠正的策略。使用了外显子跳跃法(exon
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skipping approach)，其通常指使用合成的反义寡核苷酸来抑制剪接增强子位点并防止特定外显子参与剪接(Aoki等人,2013.Biomed Res Int.2013:402369)。然而，这种外显子跳跃法不是通用的，并且仅可以用于一些具有缺失的患者，在此阅读框可以通过跳过与缺失相邻的额外外显子而恢复(Shieh,2018.Neurotherapeutics.15(4):840
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848)。外显子跳跃恢复了截短但具有部分功能的蛋白的翻译，但不能重现全长层粘连蛋白α2蛋白的益处。
[0007]CRISPR/Cas9也用于纠正LAMA2突变，特别是切除含有剪接位点突变的LAMA2内含子2区域，并通过非同源末端连接(NHEJ)产生功能性供体剪接位点，从而导致LAMA2转录物的外显子2的纳入以及全长层粘连蛋白α2链蛋白的恢复(Kemaladewi等人,2017.Nat Med.23(8):984
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989)。作为外显子跳跃，这种策略仅能用于一些患者，而不是通用的。
[0008]然而，NHEJ不适合于将大的转基因整合到基因组中，并且尽管依赖于同源指导的
修复(HDR)途径的基因修饰在理论上可以纠正大多数致病性点突变，但发现其是“极其低效的”，如Kemaladewi&Cohn(2019.Emerg Top Life Sci.3(1):11
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18)所述。总之，Kemaladewi&Cohn呼唤开发用以纠正引起肌营养不良的突变的替代策略。
[0009]最后，CRISPR/Cas9也用于诱导基因表达，其使用与转录激活结构域(例如VP64，其针对LAMA1基因的启动子)融合的催化性失活的Cas9(SadCas9)，从而允许结构类似的层粘连蛋白α1链蛋白的表达增加(Kemaladewi等人,2019.Nature.572(7767):125
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130)。然而，这种方法需要转基因的连续表达。
[0010]因此，仍然需要开发用于治疗MDC1A的永久且有效的策略，所述策略是通用的，且不仅限于受某些突变影响的某些患者。

技术实现思路

[0011]LAMA2基因的基因替换的治疗价值颇具前景，但却由于载货大小的限制而迄今为止一直面临挑战。本专利技术人使用了包含与转座酶(例如高活性PiggyBac转座酶)融合的位点特异性DNA结合蛋白(例如Cas9)的融合蛋白，将LAMA2基因的健康全长拷贝整合至细胞基因组内的特定位点中。因此，本专利技术人能够提供具有大的LAMA2表达盒(9.3kb的CDS)的治疗性载荷(payload)，用于离体和体内递送，且与不同的基因递送技术相容。
[0012]因此，本专利技术涉及一种组合物，所述组合物包含a)第一蛋白或编码所述第一蛋白的核酸构建体，所述第一蛋白包含能够结合并切割靶核酸序列的位点特异性DNA结合蛋白或由其组成；b)第二蛋白或编码所述第二蛋白的核酸构建体，所述第二蛋白包含转座酶或由转座酶组成；和c)包含编码层粘连蛋白
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α2蛋白或其功能变体或片段的转基因的核酸构建体，所述层粘连蛋白
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α2蛋白优选是SEQ ID NO：74的层粘连蛋白
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α2蛋白。
[0013]在一个实施方案中，a)和b)的第一和第二蛋白融合在一起，任选地通过接头融合在一起。
[0014]在一个实施方案中，c)的核酸构建体包含选自以下的启动子：SEQ ID NO：76的CMV启动子、SEQ ID NO：77的CAG启动子、SEQ ID NO：78的EF1
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α启动子、SEQ ID NO：79的SV
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40启动子和SEQ ID NO：80的EalbAAT启动子。在一个实施方案中，c)的核酸构建体包含SEQ ID NO：81的剪接受体(splice acceptor)。在一个实施方案中，c)的核酸构建体包含poly(A)信号序列(优选选自SEQ ID NO：83
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85)和/或隔绝元件(insulator element)(优选选自SEQ ID NO：86
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87)。在一个实施方案中，c)的核酸构建体侧翼为反向末端重复序列(ITR)，优选SEQ ID NO:88和89的5
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ITR和3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.组合物，所述组合物包含：a)第一蛋白或编码所述第一蛋白的核酸构建体，所述第一蛋白包含能够结合和切割靶核酸序列的位点特异性DNA结合蛋白或由其组成；b)第二蛋白或编码所述第二蛋白的核酸构建体，所述第二蛋白包含转座酶或由转座酶组成；以及c)包含编码层粘连蛋白
‑
α2蛋白或其功能变体或片段的转基因的核酸构建体，所述层粘连蛋白
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α2蛋白优选是SEQ ID NO：74的层粘连蛋白
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α2蛋白。2.根据权利要求1所述的组合物，其中a)和b)的所述第一蛋白和所述第二蛋白融合在一起，任选地通过接头融合在一起。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中c)的所述核酸构建体包含选自以下的启动子：SEQ ID NO：76的CMV启动子、SEQ ID NO：77的CAG启动子、SEQ ID NO：78的EF1
‑
α启动子、SEQ ID NO：79的SV
‑
40启动子和SEQ ID NO：80的EalbAAT启动子。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中c)的所述核酸构建体包含SEQ ID NO：81的剪接受体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中c)的所述核酸构建体包含ploy(A)信号序列和/或隔绝元件，所述ploy(A)信号序列优选地选自SEQ ID NO：83
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85，所述隔绝元件优选地选自SEQ ID NO：86
‑
87。6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中c)的所述核酸构建体的侧翼是反向末端重复序列(ITR)，优选是SEQ ID NO：88和89的5'
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ITR和3'
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ITR。7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中c)的所述核酸构建体包含在选自以下的载体中：质粒载体、微环载体、犬骨DNA供体载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体。8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述位点特异性DNA结合蛋白是包含Cas蛋白的RNA引导的核酸酶，并且其中所述组合物还包含引导RNA，所述引导RNA包含用于将所述LAMA2转基因整合在细胞基因组的特定位点中的靶核酸序列的互补序列，优选地，所述Cas蛋白是酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas 9蛋白。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述引导RNA包含SEQ ID NO：90至97的任一者。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述转座酶是修饰的高活性PiggyBac转座酶或睡美人转座酶，优选地是修饰的高活性PiggyBac转座酶，其与未修饰的高活性PiggyBac相比包含一个或多个增加切除活性的氨基酸突变，和与未修饰的高活性PiggyBac相比包含一个或多个降低DNA结合活性的氨基酸突变。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述高活性PiggyBac转座...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：庞培法布拉大学，
类型：发明
国别省市：