靶向基因编辑构建体及其使用方法技术

本公开提供了用于改进将外源核酸位点特异性插入基因组中的核酸构建体。在一些方面，该核酸构建体包含编码被工程化以结合特定基因组DNA序列的DNA结合蛋白的第一多核苷酸序列，包含能够将外源核酸插入基因组中的修饰的整合酶或修饰的转座酶的第二多核苷酸，和编码两个核苷酸之间的接头的核酸序列。在一些实施方案中，该核酸构建体编码融合蛋白，例如用于通过慢病毒颗粒递送至细胞的融合蛋白。通过慢病毒颗粒递送至细胞的融合蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向基因编辑构建体及其使用方法
[0001]参考以电子方式提交的序列表
[0002]与本申请一起提交的以电子方式提交的ASCII文本文件(名称：4349.001PC01_Seqlisting_ST25；大小：389,120字节；创建日期：2020年6月11日)的内容通过引用以其整体并入本文。

技术介绍

[0003]许多疾病例如癌症、发育障碍和一些感染具有共同的遗传和表观遗传畸变。将基因疗法设计为将遗传物质引入细胞以直接靶向和编辑基因组，以纠正基因功能失调的细胞，从而治愈相关疾病。锌指核酸酶(ZFN)、Talen和Crispr
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cas9基因编辑技术代表一些最近开发的用于编辑DNA的工具。方法(如电穿孔、阳离子脂质、显微注射或病毒)已用于将遗传物质递送到基因组中。当前的基因递送策略通常基于腺病毒、逆转录病毒或裸DNA质粒。
[0004]包括HIV的慢病毒在用作核酸递送的载体时是有力的工具。慢病毒能够稳定感染分裂和非分裂细胞。慢病毒载体易于随机整合到宿主基因组中，并且通常可以在高度转录的基因位点整合，这增加了插入诱变的风险。
[0005]HIV
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1整合酶催化病毒DNA插入宿主基因组。通常，HIV
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1整合酶由N
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末端结构域(NTD)、催化核心结构域(CCD)和C
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末端结构域(CTD)组成。NTD用于结合和配位作为重要辅因子的Zn2+阳离子，而CTD用于DNA结合。CCD形成催化整合过程的催化核心。病毒载体使用的插入机制的挑战包括低效率和缺乏特异性，这可导致非预期的插入诱变和遗传毒性。
[0006]专利技术概述
[0007]本公开的一些方面提供可用于核酸的靶向编辑的构建体、质粒、载体、颗粒、融合蛋白、组合物、方法和试剂盒，包括编辑受试者基因组(例如人基因组)内的单个位点或区域。
[0008]本文的工作实施例提供详细的实验数据，表明用Cas9/锌指蛋白成功产生了可编程转座酶和整合酶的融合蛋白构建体。此外，这样的构建体能够引起外源核酸序列位点特异性整合到转染细胞的基因组中。不受理论的束缚，本专利技术人相信这是首次产生了这种类型的融合蛋白，其具有将外源核酸位点特异性整合到基因组中的能力并且适合于基因治疗，尤其是涉及大基因的基因治疗。本专利技术人还鉴定了进行特异性靶向转座的修饰的超活性PiggyBac转座酶。
[0009]因此，本公开的一个方面涉及核酸构建体，其包含：
[0010]a)第一多核苷酸序列，其包含编码第一DNA结合蛋白的核酸，所述第一DNA结合蛋白被工程化以结合基因组中的特定基因组DNA序列；其中所述第一DNA结合蛋白是锌指蛋白或Cas9蛋白；
[0011]b)第二多核苷酸序列，其包含编码第二DNA结合蛋白的核酸，所述第二DNA结合蛋白能够将外源核酸插入基因组中，其中所述第二DNA结合蛋白是
[0012]i.超活性PiggyBac转座酶，或与所述超活性PiggyBac转座酶相比具有改进的将外源核酸插入基因组的特异性的修饰的超活性PiggyBac转座酶，或
[0013]ii.人免疫缺陷病毒(HIV)整合酶，或与HIV整合酶相比具有改进的将外源核酸插入基因组的特异性的修饰的HIV整合酶；以及
[0014]c)任选的多核苷酸序列，其包含编码接头的核酸；
[0015]其中所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含所述第一DNA结合蛋白、所述第二DNA结合蛋白和所述第一DNA结合蛋白与所述第二DNA结合蛋白之间的任选的接头；并且
[0016]其中所述融合蛋白能够将所述外源核酸插入所述基因组的特异性位点。
[0017]还提供了包含本文所述的核酸构建体、载体或融合蛋白和编码用于插入基因组的外源核酸的多核苷酸序列的组合物，所述组合物包含在包装载体中或与包装载体结合。
[0018]本公开还提供用于将外源核酸序列的单拷贝或多拷贝受控位点特异性整合到细胞中的方法，所述方法包括：(a)将本文所述的核酸构建体、载体或融合蛋白递送至细胞，和(b)将外源核酸递送至细胞；其中融合蛋白与细胞基因组中的特定基因组DNA序列的结合导致基因组的切割和外源核酸的一个或多个拷贝整合到细胞基因组中。
[0019]另一方面涉及提供包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的修饰的超活性PiggyBac转座酶，其中：第245位的氨基酸是A，第275位的氨基酸是R或A，第277位的氨基酸是R或A，第325位的氨基酸是A或G，第347位的氨基酸是N或A，第351位的氨基酸是E、P或A，第372位的氨基酸是R，第375位的氨基酸是A，第450位的氨基酸是D或N，第465位的氨基酸是W或A，第560位的氨基酸是T或A，第564位的氨基酸是P或S，第573位的氨基酸是S或A，第592位的氨基酸是G或S，第594位的氨基酸是L或F。
[0020]在一些实施方案中，提供了连接至(ii)Cas9或锌指蛋白的(i)整合酶、修饰的整合酶、转座酶或修饰的转座酶的融合蛋白；和编码其的核酸构建体。
[0021]本申请的某些方面涉及核酸构建体，其包含：(a)编码第一DNA结合蛋白的第一多核苷酸序列，所述第一DNA结合蛋白被工程化以结合基因组中的特定基因组DNA序列；(b)编码能够将外源核酸插入基因组中的第二DNA结合蛋白的第二多核苷酸序列，其中所述第二DNA结合蛋白是(i)整合酶或相对于野生型整合酶修饰的经修饰整合酶，或(ii)转座酶或相对于野生型转座酶修饰的经修饰转座酶；和(c)包含编码接头的核酸的第三多核苷酸序列；其中所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含所述第一DNA结合蛋白、所述第二DNA结合蛋白和所述第一DNA结合蛋白与所述第二DNA结合蛋白之间的接头。
[0022]在一些实施方案中，核酸构建体包含：(a)编码Cas9蛋白的第一多核苷酸序列；和(b)编码本公开的转座酶或修饰的超活性PiggyBac或其功能片段的第二多核苷酸序列。
[0023]在一些实施方案中，核酸构建体包含：(a)编码锌指蛋白的第一多核苷酸序列；和(b)编码本公开的整合酶或修饰的整合酶或其功能片段的第二多核苷酸序列。
[0024]在一些实施方案中，本申请涉及包含本公开的核酸构建体的质粒、载体或宿主细胞。
[0025]本申请的一些方面涉及融合蛋白，其包含：第一DNA结合蛋白，其被工程化以结合基因组中的特定基因组DNA序列；第二DNA结合蛋白，其能够将外源核酸插入基因组，其中所述第二DNA结合蛋白是整合酶、转座酶或修饰的整合酶或转座酶；和连接第一蛋白和第二蛋白的接头。
[0026]在一些实施方案中，所述融合蛋白包含：(a)Cas9蛋白；和(b)本公开的超活性
PiggyBac或修饰的超活性PiggyBac或其功能片段。
[0027]在一些实施方案中，所述融合蛋白包含：(a)锌指蛋白；和(b)本公开的整合酶或修饰的整合酶或其功能片段。
[0028]本申请的一些方面涉及包含本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.核酸构建体，其包含：a)第一多核苷酸序列，其包含编码第一DNA结合蛋白的核酸，所述第一DNA结合蛋白被工程化以结合基因组中的特定基因组DNA序列；其中所述第一DNA结合蛋白是锌指蛋白或Cas9蛋白；b)第二多核苷酸序列，其包含编码第二DNA结合蛋白的核酸，所述第二DNA结合蛋白能够将外源核酸插入基因组中，其中所述第二DNA结合蛋白是(i).超活性PiggyBac转座酶，或与所述超活性PiggyBac转座酶相比具有改进的将外源核酸插入基因组的特异性的修饰的超活性PiggyBac转座酶，或(ii).人免疫缺陷病毒(HIV)整合酶，或与HIV整合酶相比具有改进的将外源核酸插入基因组的特异性的修饰的HIV整合酶；以及c)任选的多核苷酸序列，其包含编码接头的核酸；其中所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含所述第一DNA结合蛋白、所述第二DNA结合蛋白和所述第一DNA结合蛋白与所述第二DNA结合蛋白之间的任选的接头；并且其中所述融合蛋白能够将所述外源核酸插入所述基因组的特异性位点。2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述Cas9蛋白选自下组：人Cas9、切口酶Cas9和死Cas9。3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述锌指蛋白是包含6个结构域的C2H2锌指蛋白。4.根据权利要求1
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3任一项所述的核酸构建体，其中所述接头包含XTEN序列或GGS序列。5.根据权利要求1
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4任一项所述的核酸构建体，其中所述第一多核苷酸序列的3'端连接至所述第二多核苷酸的5'端。6.根据权利要求1
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5任一项所述的核酸构建体，其中：a)所述第一DNA结合蛋白是Cas9蛋白或锌指蛋白，和b)所述第二DNA结合蛋白是超活性PiggyBac转座酶或与所述超活性PiggyBac相比具有改进的将外源核酸插入基因组中的特异性的修饰的超活性PiggyBac，其中所述核酸构建体包含(c)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含编码接头的核酸，所述接头包含XTEN序列或GGS序列，并且其中第一多核苷酸序列的3'末端连接至第二多核苷酸的5'末端。7.根据权利要求1
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5任一项所述的核酸构建体，其中：a)所述第一DNA结合蛋白是Cas9蛋白或锌指蛋白，和b)所述第二DNA结合蛋白是HIV整合酶或与HIV整合酶相比具有改进的将外源核酸插入基因组中的特异性的修饰的HIV整合酶，其中所述核酸构建体包含(c)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含编码接头的核酸，所述接头包含XTEN序列或GGS序列，并且其中第一多核苷酸序列的3'末端连接至第二多核苷酸的5'末端。8.根据权利要求1
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6任一项所述的核酸构建体，其中所述修饰的超活性PiggyBac转座酶包含对应于所述超活性PiggyBac的氨基酸序列SEQ ID NO：9的一个或多个氨基酸突变：245、268、275、277、287、290、315、325、341、346、347、350、351、356、357、372、375、388、409、
412、432、447、450、460、461、465、517、560、564、571、573、576、586、587、589、592和594。9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其中所述修饰的超活性PiggyBac转座酶包含选自以下的对应于所述超活性PiggyBac的氨基酸序列SEQ ID NO：9的一个或多个氨基酸修饰：R245A、D268N、R275A/R277A、K287A、K290A、K287A/K290A、R315A、G325A、R341A、D346N、N347A、N347S、T350A、S351E、S351P、S351A、K356E、N357A、R372A、K375A、R372A/K375A、R388A、K409A、K412A、K409A/K412A、K432A、D447A、D447N、D450N、R460A、K461A、R460A/K461A、W465A、S517A、T560A、S564P、S571N、S573A、K576A、H586A、I587A、M589V、S592G或F594L。10.根据权利要求1
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6任一项所述的核酸构建体，其中所述修饰的超活性PiggyBac转座酶包含对应于所述超活性PiggyBac的氨基酸序列SEQ ID NO：9的一个或多个氨基酸突变：245、275、277、325、347、351、372、375、388、450、465、560、564、573、589、592、594。11.根据权利要求10所述的核酸构建体，其中所述修饰的超活性PiggyBac转座酶包含选自以下的对应于所述超活性PiggyBac的氨基酸序列SEQ ID NO：9的一个或多个氨基酸修饰：R245A、R275A、R277A、R275A/R277A、G325A、N347A、N347S、S351E、S351P、S351A、R372A、K375A、R388A、D450N、W465A、T560A、S564P、S573A、M589V、S592G或F594L。12.根据权利要求10所述的核酸构建体，其中所述修饰的超活性PiggyBac转座酶包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，其中：i....

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：庞培法布拉大学，
类型：发明
国别省市：