一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种低温限制性核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用，本发明专利技术通过广泛而深入的研究，通过对蛋白进行氨基酸单位点突变，首次获得了对于KmAgo酶的活性具有显著改善的突变体蛋白，是基于kurthia massiliensis的常温核酸酶Argonaute(KmAgo，SEQ ID NO.1所示的野生型序列)的突变蛋白或其活性片段、变异形式、衍生蛋白。在果蝇胚胎体内实验中，与野生型相比，本发明专利技术突变蛋白的DNA剪切活性是野生型的8倍，并且利用突变体首次在果蝇胚胎中实现了高效的单链DNA剪切，为细胞和组织的多轮基因标记技术提供了重要的方法支持。轮基因标记技术提供了重要的方法支持。轮基因标记技术提供了重要的方法支持。

【技术实现步骤摘要】
一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程
，涉及一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]可编程核酸内切酶的出现彻底改变了基因组编辑技术，例如分子诊断和基因改造，对生命科学
、
生物安全
、
医疗和环境监测等产生了极其重要的影响
。
近几年，获得
2019
年诺贝尔生物学奖的基因编辑体系
—(CRISPR)
‑
Cas
系统备受科学家和医疗企业的关注
。
该体系能对靶向核酸的特定位点进行编辑，从而引发相应物理特征变化，实现医学诊断与治疗
。
类似于
CRISPR
‑
Cas
系统，
Argonaute
蛋白
(Ago)
同样是一类核酸介导的限制性核酸内切酶
。
该蛋白被提议为适用于一系列生物技术应用的基因编辑酶
。
相比于
Cas
蛋白分子量大
、
只能使用
RNA
作为介导核酸
、
需要
PAM
识别区等缺点，
Ago
蛋白具有分子量小
、
可使用
RNA
和
DNA
作为介导核酸
、
不需要
PAM
识别区
、/>位点识别准确率高等优点
。
上述优势使
Ago
蛋白能够被应用于高通量的基因编辑和医学筛查
。
[0003]Ago
蛋白主要包含六个结构域，包括
N
结构域，
Linker1
，
PAZ
结构域，
Linker2
，
MID
结构域以及
PIWI
结构域
。
重要的是，这些结构域的结构动态对
Ago
蛋白的生物功能至关重要
。
无配体
Ago
蛋白与引导核酸结合，其中核酸的
5'
端和
3'
端分别被容纳在
MID
结构域和
PAZ
结构域的基础口袋中
。
然后，这种导向负载复合物作为模板，通过与引导链的种子区域进行碱基配对，寻找互补的目标链
。
随后，引导链的
3'
端从
PAZ
结构域中释放出来，
Glu
‑
finger
的活性位点为正确的碱基配对而关闭
。
之后，
PIWI
结构域中的催化四元组的构象变化允许目标链的切割
。
最后，
N
结构域释放切割的目标，并且蛋白
‑
引导复合物被重新排列到其初始构象，以进行下一轮的切割
。
由于生物多样性，原核生物的
Ago(pAgo)
具有不同的适应温度
。
高温生物来源的
pAgo
在中温条件下都只有低水平的
gDNA
引导的靶
ssDNA
和
/
或靶
RNA
切割活性，这限制了基于高温
Ago
的应用开发
。
最近的研究开始集中于中温生物来源的
pAgos
，特别是来源自
kurthia massiliensis
的中温核酸酶
Argonaute(KmAgo)
蛋白，能够有效切割靶
DNA
，但其野生型切割能力弱，活性差
。
此外，
KmAgo
蛋白仍然以体外应用为主，尚无体内应用的开发
。
[0004]因此，针对该蛋白迫切需要得到具有高剪切活性的
KmAgo
突变体，并开发出将其特性应用于体内实验的场景
。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白及其制备方法与应用，实现了果蝇胚胎体内对
KmAgo
突变体对目标
DNA
的高效剪切
。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、
一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白
KmAgo
或其活性片段
、
变异形式
、
衍生蛋白，所述常温限制性核酸内切酶来源于中温原核生物
kurthia massiliensis
，所述的突变
蛋白
KmAgo
具有以下单位点的核心氨基酸突变：
[0008]D30E
[0009]其中，所述突变位点的编号基于
SEQ ID NO.1
所示的序列
。
所述
KmAgo
突变蛋白除所述氨基酸突变以外，其余序列与
SEQ ID NO.1
所示的序列相同或基本相同
。
[0010]作为优选的技术方案之一，所述常温为
37℃
，为大多数常温生命体最适生长温度
。
[0011]作为优选的技术方案之一，所述的
KmAgo
突变蛋白的果蝇胚胎体内
DNA
剪切活性
Q1
，与野生型的果蝇胚胎体内
DNA
剪切活性
Q0
的比值：
Q1/Q0
比值为
8。
[0012]蛋白的修饰
(
通常不改变一级结构
)
，具体形式包括：体内的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化；糖基化；具有磷酸化氨基酸残基
(
如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸
)
的序列；被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白；前述突变蛋白或其活性片段与其他蛋白或标记物形成的融合蛋白或偶联物
。
[0013]2、
一种分离的多核苷酸，其编码前述突变蛋白
KmAgo
或其活性片段
、
变异形式
、
衍生蛋白
。
[0014]3、
一种载体，其含有前述分离的多核苷酸
。
[0015]作为优选的技术方案之一，所述载体为重组表达载体，是指本领域熟知的细菌质粒
、
噬菌体
、
酵母质粒
、
植物细胞病毒
、
哺乳动物细胞病毒或其他载体
。
总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白
KmAgo
或其活性片段
、
变异形式
、
衍生蛋白，其特征在于，所述常温限制性核酸内切酶来源于中温原核生物
kurthia massiliensis
，所述的突变蛋白
KmAgo
具有以下单位点的核心氨基酸突变：
D30E
其中，所述突变位点的编号基于
SEQ ID NO.1
所示的序列
。
所述
KmAgo
突变蛋白除所述氨基酸突变以外，其余序列与
SEQ ID NO.1
所示的序列相同或基本相同
。2.
一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述突变蛋白
KmAgo
或其活性片段
、
变异形式
、
衍生蛋白
。3.
一种载体，其特征在于，其含有权利要求2所述分离的多核苷酸
。4.
一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求3所述载体，或其核酸中含有权利要求2所述分离的多核苷酸
。5.
权利要求1所述一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白
KmAgo
或其活性片段
、
变异形式
、
衍生蛋白的制备方法，其特征在于，培养前述宿主细胞，从而表达所述的突变蛋白或其活性片段
、
变异形式
、
衍生蛋白
。6.
权利要求1所述一种常温限制性核酸内切酶突变蛋白
KmAgo
或其活性片段
、
变异形式
、
衍...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑力荣，路红芳，吴邦昊，徐恒，洪亮，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：