多重RNA靶向制造技术

技术编号:39407465 阅读:18 留言:0更新日期:2023-11-19 15:59
在一些方面中,本文提供了一种多重RNA靶向系统,其能够对多个RNA靶进行活细胞成像和/或修饰。具体地,本发明专利技术提供了一种核糖核酸(RNA)的活细胞成像或靶向活细胞中RNA方法,包括:(a)向细胞递送RNA编辑复合物,所述RNA编辑复合物包含催化失活的Casl3(dCasl3)核酸酶、包含RNA适配体序列的Cas13引导RNA(gRNA),和连接至RNA结合结构域(RBD)的可检测分子,或连接至RBD序列的RNA效应分子,所述RBD序列特异性结合至所述RNA适配体序列;(b)对可检测分子或RNA适配体与RBD结合进行成像。或RNA适配体与RBD结合进行成像。或RNA适配体与RBD结合进行成像。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多重RNA靶向
[0001]政府许可权利
[0002]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的
R01

HG009900

01
项目的政府支持下完成的

政府在本专利技术中具有一定权利

[0003]相关申请
[0004]本申请根据美国
35 U.S.C.
§
119(e)
要求于
2021
年3月5日提交的美国临时申请
63/157,088
号的权益,其全部内容通过引用并入本文

[0005]序列表
[0006]本申请包含已经以
ASCII
格式电子提交的序列表,并且其全部内容在此通过引用并入本文


2022
年3月3日创建的所述
ASCII
拷贝被命名为
J022770104WO00

SEQ

EMB.txt
,并且大小为
64,808
字节


技术介绍

[0007]转录后调控在
RNA
水平上控制基因表达,其功能障碍与很多疾病有关

其通过多种
RNA
结合蛋白调节
RNA
的成熟

化学修饰

稳定性

定位和翻译

一旦转录,前
mRNAr/>被剪接以去除内含子并将外显子连接成一个转录物,并添加5’
帽和3’
poly

A
尾以产生成熟的
mRNA。
然后成熟的
mRNA
从细胞核转运到细胞质进行翻译,产生功能性蛋白,并然后根据需要降解
。RNA
加工步骤一起协调以紧密调节基因表达,并且任何一个步骤的失败都可能导致严重疾病


技术实现思路

[0008]在一些方面中,本文提供了一种能够进行多重
RNA
成像和
/
或加工的工具箱

该工具箱利用
RNA
适配体的多功能性和工程化
RNA
靶向成簇规则间隔回文重复序列
(CRISPR/Cas)(CRISPR/Cas)
系统的精确性,共同提供例如复杂的活细胞成像平台

[0009]本文提供的数据表明,利用该技术,工程化
Cas13
变体酶的引导
RNA(gRNA)
可以利用不同
RNA
适配体进行标记,所述
RNA
适配体设计为募集与适配体结合
RNA
结合结构域
(RBD)(
例如,
PUF/MCP/PCP)
融合的不同蛋白和
/
或肽
(
例如,
RNA
效应分子
)
,以执行不同的
RNA
结合和
/
或加工功能
(

1B)。
通过将靶特异性
gRNA
上的
RNA
适配体与同源
RBD
融合蛋白
(
例如,可检测的和
/
或功能性的
)
配对,本文的方法可用于用单个
RNA
引导的酶实现同一细胞中多个
RNA
的多色成像,以及在一些实施方式中,调节不同的
RNA
过程

此外,可以将不同的
RNA
适配体添加到相同的
gRNA
中,以协调给定靶标上的多个成像和
/
或处理步骤或组装多蛋白复合物

如本文所示,通过用多个拷贝的
Pumilio
结合位点基序靶向基因的内含子以成像其新生转录物,使用多重
RNA
系统来克服非重复
RNA
序列标记的障碍

令人吃惊的是,用这种多重
RNA
系统的工具共转染的哺乳动物细胞在细胞核中显示出明亮的荧光焦点,对应于特定基因座的新生转录物
(

6)。
[0010]因此,在一些方面中,本公开内容提供了一种活细胞
RNA
成像的方法,其包括:
(a)
向细胞递送
RNA
编辑复合物,所述
RNA
编辑复合物包含没有催化活性的
Cas13(dCas13)
核酸


包含
RNA
适配体序列的
Cas13 gRNA
和连接至
RBD
序列的可检测分子,所述
RBD
序列特异性结合至
RNA
适配体序列;和
(b)
对可检测分子成像

[0011]在一些实施方式中,
dCas13
核酸酶是前
crRNA
加工缺陷的

在一些实施方式中,
dCas13
核酸酶是
dCas13b
核酸酶

在一些实施方式中,
dCas13
核酸酶是普雷沃菌属
(Prevotella)dCas13
核酸酶

在一些实施方式中,普雷沃菌属
dCas13
核酸酶是普雷沃菌属种
P5

125(Prevotella sp.P5

125)dCas13
核酸酶
(PspdCas13)。
[0012]在一些实施方式中,
dCas13
核酸酶在对应于
SEQ ID NO:1
的氨基酸序列的氨基酸位置
367

370
的一个或多个位置处包含突变

在一些实施方式中,在对应于
SEQ ID NO:1
的氨基酸位置
367

370
的一个或多个位置处的突变为至非极性中性氨基酸的突变

在一些实施方式中,非极性中性氨基酸是丙氨酸

[0013]在一些实施方式中,
RNA
适配体选自
Pumilio
适配体序列
、MS2
适配体序列和
PP7
适配体序列

在一些实施方式中,
RNA
适配体序列是
Pumilio
适配体序列且
RBD
序列是
Pumilio
结合结构域序列...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种核糖核酸
(RNA)
的活细胞成像方法,其包括:
(a)
向细胞递送
RNA
编辑复合物,所述
RNA
编辑复合物包含没有催化活性的
Cas13(dCas13)
核酸酶,包含
RNA
适配体序列的
Cas13
引导
RNA(gRNA)
,和连接至
RNA
结合结构域
(RBD)
序列的可检测分子,所述
RNA
结合结构域序列特异性结合至所述
RNA
适配体序列;和
(b)
对所述可检测分子成像
。2.
根据权利要求1所述的方法,其中所述
dCas13
核酸酶是前
crRNA
加工缺陷的
。3.
根据权利要求1或2所述的方法,其中所述
dCas13
核酸酶是
dCas13b
核酸酶
。4.
根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述
dCas13
核酸酶是普雷沃菌属
dCas13
核酸酶
。5.
根据权利要求4所述的方法,其中所述普雷沃菌属
dCas13
核酸酶是普雷沃菌属种
P5

125dCas13
核酸酶
(PspdCas13)。6.
根据权利要求2‑5中任一项所述的方法,其中所述
dCas13
核酸酶在对应于
SEQ ID NO:1
的氨基酸序列的氨基酸位置
367

370
的一个或多个位置处包含突变
。7.
根据权利要求6所述的方法,其中在对应于
SEQ ID NO:1
的氨基酸序列的氨基酸位置
367

370
的一个或多个位置处的所述突变是被突变为非极性中性氨基酸
。8.
根据权利要求7所述的方法,其中所述非极性中性氨基酸是丙氨酸
。9.
根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述
RNA
适配体选自
Pumilio
适配体序列
、MS2
适配体序列和
PP7
适配体序列
。10.
根据权利要求9所述的方法,其中所述
RNA
适配体序列是
Pumilio
适配体序列且所述
RBD
序列是
Pumilio
结合结构域序列
。11.
根据权利要求9所述的方法,其中所述
RNA
适配体序列是
MS2
适配体序列且所述
RBD
序列是
MS2
衣壳蛋白
(MCP)
序列
。12.
根据权利要求9所述的方法,其中所述
RNA
适配体序列是
PP7
适配体序列且所述
RBD
序列是
PP7
衣壳蛋白
(PCP)
序列
。13.
根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述
Cas13gRNA
结合至非重复
RNA
序列
。14.
一种靶向活细胞中核糖核酸
(RNA)
的方法,其包括:
(a)
向活细胞递送
RNA
编辑复合物,所述
RNA
编辑复合物包含没有催化活性的
Cas13(dCas13)
核酸酶,包含
RNA
适配体序列的
Cas13
引导
RNA(gRNA)
,和连接至
RNA
结合结构域
(RBD)
序列的
RNA
效应分子,所述
RNA
结合结构域
(RBD)

【专利技术属性】
技术研发人员:郑瑚刘族凯
申请(专利权)人:杰克逊实验室
类型:发明
国别省市:

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