【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、cas酶以及其相关的成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)向导核糖核酸(rna)似乎是原核免疫系统的普遍组分(约45％的细菌，约84％的古细菌)，用于通过crispr-rna引导的核酸切割来保护此类微生物免受非自身核酸，如传染性病毒和质粒的侵害。虽然编码crispr rna元件的脱氧核糖核酸(dna)元件在结构和长度上可能相对保守，但其crispr相关(cas)蛋白是高度多样化的，含有多种核酸相互作用结构域。虽然早在1987年就观察到crispr dna元件，但crispr/cas复合物的可编程核酸内切酶切割能力直到最近才被认识到，从而引起重组crispr/cas系统在各种dna操纵和基因编辑应用中的使用。
2、序列表
3、本申请含有已经以xml格式电子提交的序列表，并且特此通过引用以其整体并入。创建于2022年9月6日的所述xml副本命名为55921-732601_revised_2.xml并且大小为1,114,268字节。
技术实现思路
1、...
【技术保护点】
1.一种经工程化的核酸酶系统，其包括：
2.根据权利要求1所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述向导RNA包括与SEQ ID NO:410-419、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472和474中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述核酸内切酶与SEQ ID NO:30-33、39、48、56、57、61、83、92、100、110、12...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经工程化的核酸酶系统，其包括：
2.根据权利要求1所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述向导rna包括与seq id no:410-419、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472和474中的任一者的非简并核苷酸具有至少80％序列同一性的序列。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述核酸内切酶与seq id no:30-33、39、48、56、57、61、83、92、100、110、124、136、145、148、424、425、429、476或629中的任一者具有至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述向导rna包括与seq id no:414-419、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472和474中的任一者的非简并核苷酸具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的序列。
5.一种经工程化的核酸酶系统，其包括：
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述向导rna包括与真核、真菌、植物、哺乳动物或人基因组多核苷酸序列互补的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述向导rna的长度为30-250个核苷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述核酸内切酶包括接近所述核酸内切酶的n末端或c末端的一个或多个核定位序列(nls)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述nls包括与选自由seq id no:630-645组成的组的序列至少80％相同的序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其进一步包括单链或双链dna修复模板，所述单链或双链dna修复模板从5'至3'包括：第一同源臂，所述第一同源臂包括位于所述靶脱氧核糖核酸序列的5'的至少20个核苷酸的序列；至少10个核苷酸的合成dna序列；以及第二同源臂，所述第二同源臂包括位于所述靶序列的3'的至少20个核苷酸的序列。
11.根据权利要求10所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述第一同源臂或所述第二同源臂包括至少40、80、120、150、200、300、500或1,000个核苷酸的序列。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂与原核生物、细菌、真菌或真核生物的基因组序列同源。
13.根据权利要求10至12所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述单链或双链dna修复模板包括转基因供体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其进一步包括dna修复模板，所述dna修复模板包括侧接有一个或两个单链dna区段的双链dna区段。
15.根据权利要求14所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述单链dna区段与所述双链dna区段的5'端缀合。
16.根据权利要求14所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述单链dna区段与所述双链dna区段的3'端缀合。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述单链dna区段的长度为4至10个核苷酸碱基。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述单链dna区段具有与所述间隔子序列内的序列互补的核苷酸序列。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述双链dna序列包括条形码、开放阅读框、增强子、启动子、蛋白质编码序列、mirna编码序列、rna编码序列或转基因。
20.根据权利要求14至18中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述双链dna序列侧接有核酸酶切割位点。
21.根据权利要求20所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述核酸酶切割位点包括间隔子和pam序列。
22.根据权利要求21所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述pam包括seq id no:433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473和475中的任一者的序列。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述系统进一步包括mg2+的来源。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述向导rna包括发夹，所述发夹包括至少8个、至少10个或至少12个碱基配对的核糖核苷酸。
25.根据权利要求24所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述发夹包括10个碱基配对的核糖核苷酸。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中：
27.根据权利要求1至25中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中：
28.根据权利要求1至27中任一项所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述序列同一性是通过blastp、clustalw、muscle、mafft算法或clustalw算法使用史密斯-沃特曼同源性搜索算法参数(smith-waterman homology search algorithm parameter)来确定的。
29.根据权利要求28所述的经工程化的核酸酶系统，其中所述序列同一性是通过所述blastp同源性搜索算法使用字长(w)为3、期望值(e)为10的参数以及blosum62评分矩阵将空位罚分设置为存在11，扩展1并且使用条件组成评分矩阵调整来确定的。
30.一种经工程化的向导核糖核酸(rna)多核苷酸，其包括：
31.根据权利要求30所述的经工程化的向导rna，其中所述2型v类cas核酸内切酶源自未经培养的生物体。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的经工程化的向导核糖核酸多核苷酸，其中所述cas核酸内切酶与seq id no:1-325、420-431、476-624或629中的任一者具有至少75％序列同一性，并且将所述复合物靶向到所述靶dna分子的所述靶序列。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的经工程化的向导核糖核酸多核苷酸，其中所述dna靶向区段定位在所述两个互补的核苷酸延伸段中的两者的3'。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的经工程化的向导核糖核酸多核苷酸，其中所述蛋白质结合区段包括与seq id no:410-419的非简并核苷酸具有至少70％、至少80％或至少90％同一性的序列。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的经工程化的向导核糖核酸多核苷酸，其中所述双链rna(dsrna)双链体包括至少5个、至少8个、至少10个或至少12个核糖核苷酸。
36.一种脱氧核糖核酸多核苷酸，其编码根据权利要求30至35中任一项所述的经工程化的向导核糖核酸多核苷酸。
37.一种核酸，其包括经工程化的核酸序列，所述经工程化的核酸序列被优化以在生物体中表达，其中所述核酸编码2类v型cas核酸内切酶，并且其中所述核酸内切酶源自未经培养的微生物，其中所述生物体不是所述未经培养的生物体。
38.根据权利要求37所述的核酸，其中所述核酸内切酶包括与seq id no:1-325、420-431、476-624或629中的任一者具有至少70％或至少80％序列同一性的变体。
39.根据权利要求37或38所述的核酸，其中所述核酸内切酶包括编码接近所述核酸内切酶的n末端或c末端的一个或多个核定位序列(nls)的序列。
40.根据权利要求39所述的核酸，其中所述nls包括选自seq id no:630-645的序列。
41.根据权利要求39或40所述的核酸，其中所述nls包括seq id no:631。
42.根据权利要求41所述的核酸，其中所述nls接近所述核酸内切酶的所述n末端。
43.根据权利要求39或40所述的核酸，其中所述nls包括seq id no:630。
44.根据权利要求43所述的核酸，其中所述nls接近所述核酸内切酶的所述c末端。
45.根据权利要求37至44中任一项所述的核酸，其中所述生物体是原核生物、细菌、真核生物、真菌、植物、哺乳动物、啮齿动物或人。
46.一种经工程化的载体，其包括核酸序列，所述核酸序列编码2类v型cas核酸内切酶，其中所述核酸内切酶源自未经培养的微生物。
47.一种经工程化的载体，其包括根据权利要求37至45中任一项所述的核酸。
48.一种经工程化的载体，其包括根据权利要求36所述的脱氧核糖核酸多核苷酸。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的经工程化的载体，其中所述载体是质粒、微环、celid、腺相关病毒(aav)源性病毒体、慢病毒或腺病毒。
50.一种细胞，其包括根据权利要求46至49中任一项所述的经工程化的载体。
51.一种制备核酸内切酶的方法，所述方法包括培养根据权利要求50所述的所述细胞。
52.一种用于结合、切割、标记或修饰双链脱氧核糖核酸多核苷酸的方法，所述方法包括：
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述双链脱氧核糖核酸多核苷酸包括第一链和第二链，所述第一链包括与所述经工程化的向导rna的序列互补的序列，所述第二链包括所述pam。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述pam与和所述经工程化的向导rna的所述序列互补的所述序列的5'端直接相邻。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中所述pam包括seq id no:433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473和475中的任一者的序列。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的方法，其中所述2类v型cas核酸内切酶源自未经培养的微生物。
57.根据权利要求52至56中任一项所述的方法，其中所述2类v型cas核酸内切酶进一步包括pam相互作用结构域。
58.根据权利要求52至57中任一项所述的方法，其中所述双链脱氧核糖核酸多核苷酸是真核生物、植物、真菌、哺乳动物、啮齿动物或人双链脱氧核糖核酸多核苷酸。
59.一种修饰靶核酸基因座的方法，所述方法包括向所述靶核酸基因座递送根据权利要求1至29中任一项所述的所述经工程化的核酸酶系统，其中所述核酸内切酶被配置成与所述经工程化的向导核糖核酸结构形成复合物，并且其中所述复合物被配置成使得在所述复合物与所述靶核酸基因座结合时，所述复合物修饰所述靶核酸基因座。
60.根据权利要求59所述的方法，其中修饰所述靶核酸基因座包括结合、切口、切割或标记所述靶核酸基因座。
61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述靶核酸基因座包括脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。
62.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶核酸包括基因组dna、病毒dna、病毒rna或细菌dna。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述靶核酸基因座是在体外的。
64.根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述靶核酸基因座是在细胞内的。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述细胞是原核细胞、细菌细胞、真核细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞或原代细胞。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述原代细胞是t细胞。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述原代细胞是造血干细胞(hsc)。
69.根据权利要求59至68中任一项所述的方法，其中向所述靶核酸基因座递送所述经工程化的核酸酶系统包括递送根据权利要求37至45中任一项所述的核酸或根据权利要求46至49中任一项所述的经工程化的载体。
70.根据权利要求59至69中任一项所述的方法，其中向所述靶核酸基因座递送所述经工程化的核酸酶系统包括递送包括编码所述核酸内切酶的开放阅读框的核酸。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述核酸包括启动子，编码所述核酸内切酶的所述开放阅读框与所述启动子可操作地连接。
72.根据权利要求59至71中任一项所述的方法，其中向所述靶核酸基因座递送所述经工程化的核酸酶系统包括递送包含编码所述核酸内切酶的所述开放阅读框的加帽mrna。
73.根据权利要求59至72中任一项所述的方法，其中向所述靶核酸基因座递送所述经工程化的核酸酶系统包括递送经翻译的多肽。
74.根据权利要求59至72中任一项所述的方法，其中向所述靶核酸基因座递送所述经工程化的核酸酶系统包括递送编码与核糖核酸(rna)pol iii启动子可操作地连接的所述经工程化的向导rna的脱氧核糖核酸(dna)。
75.根据权利要求59至74中任一项所述的方法，其中所述核酸内切酶诱导所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·C·托马斯，克利斯多佛·布朗，辛迪·卡斯泰勒，利萨·亚历山大，利利安娜·冈萨雷斯奥索里奥，保拉·马瑟斯卡尔内瓦利，多姆·卡斯坦佐，
申请(专利权)人：宏基因组学公司，
类型：发明
国别省市：
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