【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、先导编辑(prime editing)技术是一种基因编辑技术，其可以在靶基因组中进行靶向的插入、删除以及所有的颠换和转换点突变。本公开提供了允许高效且精确地编辑靶基因的改进的先导编辑方法和组合物。
技术实现思路
1、本文在一些实施方案中提供了用于对靶dna(例如，靶基因)中的靶序列中的改变进行高效先导编辑的方法和组合物。
2、不希望受任何特定理论的束缚，先导编辑方法可搜索并替换靶多核苷酸中的内源序列。如图3中所例示，先导编辑引导rna(pegrna)的间隔区序列识别双链靶多核苷酸(例如，双链靶dna)的靶链中的搜索靶序列并与之退火。先导编辑复合物可以在作为靶链的互补链的编辑链上的靶dna中产生切口。然后先导编辑复合物可使用在编辑链的切口位点处形成的游离3’端来启动dna合成，其中pegrna的引物结合位点序列(pbs)与游离3’端复合，并且使用pegrna的编辑模板作为模板来合成单链dna。与内源双链靶dna序列相比，编辑模板可包含一个或多个预期的核苷酸编辑。因此，新合成的单链dna还包含一个或多个由编辑模板编码的核苷酸编辑。通过移除双链靶dna的编辑链上的编辑靶序列和dna修复机制，新合成的单链dna替换编辑靶序列，并且一个或多个所需的核苷酸编辑被并入到双链靶dna中。
3、本文在一些实施方案中提供了可彼此缔合并高效地将预期的核苷酸编辑并入在双链靶dna中的经修饰的先导编辑器(pe)多肽、经修饰的pegrna，以及使用其在特定的细胞类型(例
4、在一个方面，本文提供了包含融合蛋白质或编码该融合蛋白质的多核苷酸的先导编辑组合物，其中该融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中该肽接头包含与选择自由seq id no.289、291、293、294、295、301、302、303、306、309、310和311组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
5、在一个方面，本文提供了包含融合蛋白质或编码该融合蛋白质的多核苷酸的先导编辑组合物，其中该融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中该肽接头包含与选择自由seq id no.286-411组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
6、在一些实施方案中，肽接头的氨基酸序列与所选择的序列具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所选择的序列是seq id no:302。在一些实施方案中，所选择的序列是seq id no:309。
7、在一个方面，本文提供了包含融合蛋白质或编码该融合蛋白质的多核苷酸的先导编辑组合物，其中该融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中该肽接头包含至少4个连续的sggs基序。
8、在一个方面，本文提供了包含融合蛋白质或编码该融合蛋白质的多核苷酸的先导编辑组合物，其中该融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中该肽接头包含4至10个连续的sggs基序。
9、在一些实施方案中，肽接头包含4、5、6、8或10个连续的sggs基序。
10、在一个方面，本文提供了包含融合蛋白质或编码该融合蛋白质的多核苷酸的先导编辑组合物，其中该融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中该肽接头包含至少2个连续的eaaak基序。
11、在一个方面，本文提供了包含融合蛋白质或编码该融合蛋白质的多核苷酸的先导编辑组合物，其中该融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中该肽接头包含2至8个连续的eaaak基序。
12、在一些实施方案中，肽接头包含2、3、4、6或8个连续的eaaak基序。在一些实施方案中，dna聚合酶结构域包含逆转录酶(rt)结构域。在一些实施方案中，rt结构域是莫洛尼鼠白血病病毒(m-mlv)rt结构域。在一些实施方案中，m-mlv rt结构域包含与seq id no:5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸。在一些实施方案中，m-mlv rt结构域包含在对应于如seq id no:1中所示的氨基酸504和505的位置之间的c末端处被截短的氨基酸序列。在一些实施方案中，m-mlv rt结构域包含与seq id no:36具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
13、在一些实施方案中，m-mlv rt结构域包含在对应于如seq idno:1中所示的氨基酸478和479的位置之间的c末端处被截短的氨基酸序列。在一些实施方案中，m-mlv rt结构域包含与seq id no:54具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
14、在一个方面，本公开提供了先导编辑组合物，其包含：a)dna结合结构域或编码该dna结合结构域的多核苷酸，和b)莫洛尼鼠白血病逆转录酶(m-mlv rt)结构域或编码该m-mlv rt结构域的多核苷酸，其中该m-mlv rt结构域包含在对应于如seq id no:1中所示的氨基酸504和505的位置之间的c末端处被截短的氨基酸序列。
15、在一个方面，本文提供了先导编辑组合物，其包含a)dna结合结构域或编码该dna结合结构域的多核苷酸，和b)莫洛尼鼠白血病逆转录酶(m-mlv rt)结构域或编码该m-mlvrt结构域的多核苷酸，其中该m-mlv rt结构域在对应于如seq id no:1中所示的氨基酸478和479的位置之间的c末端处被截短。
16、在一些实施方案中，该m-mlv rt结构域包含与如seq id no:1中所示的参考m-mlvrt相比的氨基酸取代d200n、t306k、w313f、t330p或其任何组合。在一些实施方案中，dna结合结构域与融合蛋白质中的m-mlv rt结构域连接。在一些实施方案中，dna结合结构域和m-mlv rt结构域通过肽接头连接。在一些实施方案中，肽接头包含与选择自由seq id no286-411组成的组的序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、9本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的DNA结合结构域和DNA聚合酶结构域，其中所述肽接头包含与选择自由SEQ ID No.289、291、293、294、295、301、302、303、306、309、310和311组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
2.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的DNA结合结构域和DNA聚合酶结构域，其中所述肽接头包含与选择自由SEQ ID No.286-411组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的先导编辑组合物，其中所述肽接头的所述氨基酸序列与所选择的序列具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是SEQ IDNO
5.如权利要求1-3中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是SEQ IDNO:309。
6.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的DNA结合结构域和DNA聚合酶结构域，其中所述肽接头包含至少4个连续SGGS基序。
7.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的DNA结合结构域和DNA聚合酶结构域，其中所述肽接头包含4至10个连续SGGS基序。
8.如权利要求7所述的先导编辑组合物，其中所述肽接头包含4、5、6、8或10个连续SGGS基序。
9.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的DNA结合结构域和DNA聚合酶结构域，其中所述肽接头包含至少2个连续EAAAK基序。
10.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的DNA结合结构域和DNA聚合酶结构域，其中所述肽接头包含2至8个连续EAAAK基序。
11.如权利要求10所述的先导编辑组合物，其中所述肽接头包含2、3、4、6或8个连续EAAAK基序。
12.如权利要求1-11中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述DNA聚合酶结构域包含逆转录酶(RT)结构域。
13.如权利要求12所述的先导编辑组合物，其中所述RT结构域是莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)RT结构域。
14.如权利要求13所述的先导编辑组合物，其中所述M-MLV RT结构域包含与SEQ IDNO:5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸。
15.如权利要求13所述的先导编辑组合物，其中所述M-MLV RT结构域包含在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸504和505的位置之间的C末端处被截短的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的先导编辑组合物，其中所述M-MLV RT结构域包含与SEQ IDNO:36具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求13所述的先导编辑组合物，其中所述M-MLV RT结构域包含在对应于如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸478和479的位置之间的C末端处被截短的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的先导编辑组合物，其中所述M-MLV RT结构域包含与SEQ IDNO:54具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
19.一种先导编辑组合物，其包含：a)DNA结合结构域或编码所述DNA结合结构域的多核苷酸，和b)莫洛尼鼠白血病逆转录酶(M-MLV RT)结构域或编码所述M-MLV RT结构域的多核苷酸，其中所述M-MLV RT结构域包含在对应于如SEQ I...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中所述肽接头包含与选择自由seq id no.289、291、293、294、295、301、302、303、306、309、310和311组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
2.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中所述肽接头包含与选择自由seq id no.286-411组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的先导编辑组合物，其中所述肽接头的所述氨基酸序列与所选择的序列具有至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是seq idno:302。
5.如权利要求1-3中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是seq idno:309。
6.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中所述肽接头包含至少4个连续sggs基序。
7.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中所述肽接头包含4至10个连续sggs基序。
8.如权利要求7所述的先导编辑组合物，其中所述肽接头包含4、5、6、8或10个连续sggs基序。
9.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中所述肽接头包含至少2个连续eaaak基序。
10.一种先导编辑组合物，其包含融合蛋白质或编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述融合蛋白质包含经由肽接头连接的dna结合结构域和dna聚合酶结构域，其中所述肽接头包含2至8个连续eaaak基序。
11.如权利要求10所述的先导编辑组合物，其中所述肽接头包含2、3、4、6或8个连续eaaak基序。
12.如权利要求1-11中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述dna聚合酶结构域包含逆转录酶(rt)结构域。
13.如权利要求12所述的先导编辑组合物，其中所述rt结构域是莫洛尼鼠白血病病毒(m-mlv)rt结构域。
14.如权利要求13所述的先导编辑组合物，其中所述m-mlv rt结构域包含与seq idno:5具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸。
15.如权利要求13所述的先导编辑组合物，其中所述m-mlv rt结构域包含在对应于如seq id no:1中所示的氨基酸504和505的位置之间的c末端处被截短的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的先导编辑组合物，其中所述m-mlv rt结构域包含与seq idno:36具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求13所述的先导编辑组合物，其中所述m-mlv rt结构域包含在对应于如seq id no:1中所示的氨基酸478和479的位置之间的c末端处被截短的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的先导编辑组合物，其中所述m-mlv rt结构域包含与seq idno:54具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
19.一种先导编辑组合物，其包含：a)dna结合结构域或编码所述dna结合结构域的多核苷酸，和b)莫洛尼鼠白血病逆转录酶(m-mlv rt)结构域或编码所述m-mlv rt结构域的多核苷酸，其中所述m-mlv rt结构域包含在对应于如seq id no:1中所示的氨基酸504和505的位置之间的c末端处被截短的氨基酸序列。
20.一种先导编辑组合物，其包含a)dna结合结构域或编码所述dna结合结构域的多核苷酸，和b)莫洛尼鼠白血病逆转录酶(m-mlv rt)结构域或编码所述m-mlv rt结构域的多核苷酸，其中所述m-mlv rt结构域在对应于如seq id no:1中所示的氨基酸478和479的位置之间的c末端处被截短。
21.如权利要求19或20所述的先导编辑组合物，其中所述m-mlv rt结构域包含与如seqid no:1中所示的参考m-mlv rt相比的氨基酸取代d200n、t306k、w313f、t330p或其任何组合。
22.如权利要求19-21中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述dna结合结构域与融合蛋白质中的所述m-mlv rt结构域连接。
23.如权利要求22所述的先导编辑组合物，其中所述dna结合结构域和所述m-mlv rt结构域通过肽接头连接。
24.如权利要求23所述的先导编辑组合物，其中所述肽接头包含与选择自由seq id no286-411组成的组的序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述dna结合结构域包含crispr相关(cas)蛋白质。
26.如权利要求25所述的先导编辑组合物，其中所述cas蛋白质是ii型cas蛋白质。
27.如权利要求26所述的先导编辑组合物，其中所述cas蛋白质是cas9。
28.如权利要求27所述的先导编辑组合物，其中所述cas9蛋白质是包含位于hnh结构域中的突变的切口酶。
29.如权利要求28所述的先导编辑组合物，其中所述cas9蛋白质包含与seq id no:2相比的h840a突变。
30.如权利要求29所述的先导编辑组合物，其中所述dna结合结构域包含与seq id no:7具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求25所述的先导编辑组合物，其中所述cas蛋白质是v型cas蛋白质。
32.如权利要求31所述的先导编辑组合物，其中所述cas蛋白质是cas12a、cas12b、cas12c、cas12d或cas12e。
33.如权利要求1-18和22-32中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质从n末端至c末端包含所述dna聚合酶结构域和所述dna结合结构域。
34.如权利要求1-18和22-32中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质从c末端至n末端包含所述dna聚合酶结构域和所述dna结合结构域。
35.如权利要求34所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质包含与选择自由seqid no 78、105、117、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221和227组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
36.如权利要求35所述的先导编辑组合物，其中所选择的序列是seq id no 78。
37.如权利要求35所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是seq id no 105。
38.如权利要求34所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质包含与选择自由seqid no 86、111、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、188、194、200、206、212、218、224和230组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
39.如权利要求38所述的先导编辑组合物，其中所选择的序列是seq id no:86。
40.如权利要求38所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是seq id no:111。
41.如权利要求35-40中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质包含与所述所选择的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
42.如权利要求34-41中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质包含一个或多个核定位信号(nls)。
43.如权利要求42所述的先导编辑组合物，其中所述一个或多个nls包含选择自由seqid no 8-15或621组成的组的氨基酸序列。
44.如权利要求42所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质包含与选择自由seqid no 77、93、104、116和620组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
45.如权利要求44所述的先导编辑组合物，其中所选择的序列是seq id no:77或seqid no:620。
46.如权利要求44所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是seq id no:93。
47.如权利要求42所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质包含与选择自由seqid no 85、96、110和622组成的组的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
48.如权利要求47所述的先导编辑组合物，其中所选择的序列是seq id no:85或seqid no:622。
49.如权利要求48所述的先导编辑组合物，其中所述所选择的序列是seq id no:110。
50.如权利要求44-49中任一项所述的先导编辑组合物，其中所述融合蛋白质包含与所述所选择的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
51.如权利要求1-18和22-50中任一项所述的先导编辑组合物，其包含所述编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与选择自由seq id no:81、82、108、109、120、121、126、127、132、133、138、139、144、145、150、151、156、157、162、163、168、169、174、175、180、181、186、187、192、193、198、199、204、205、210、211、216、217、222、223、228和229组成的组的序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
52.如权利要求51所述的先导编辑组合物，其中所选择的序列是seq id no 81或82。
53.如权利要求1-18和22-50中任一项所述的先导编辑组合物，其包含所述编码所述融合蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与选择自由seq id no 89、90、102、103、114、115、123、124、129、130、135、136、141、142、147、148、153、154、159、160、165、166、171、172、177、178、183、184、189、190、195、196、201、202、207、208、213、214、219、220、225、226、231和232组成的组的序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
54.如权利要求53所述的先导编辑组合物，其中所选择的序列是seq id no 89或90。
55.如权利要求1-18和22-50中任一项所述的先导编辑组合物，其包含所述编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：霍利·A·里斯，迈克尔·帕克，路易斯·巴雷拉，伊恩·斯雷梅克，
申请(专利权)人：先导医药公司，
类型：发明
国别省市：
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