【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，特别是涉及人met基因14号外显子跳跃突变核酸标准物质及应用。
技术介绍
1、研究发现，met（mesenchymal-epithelial transition factor）基因14号外显子跳跃突变是met基因最常见的突变之一，也是肺癌的重要致癌因素。met基因14号外显子热点突变区域主要有4类：14号内含子的5'端剪接供体位点（splice donor，sd site）和13号内含子3'剪接受体位点（splice acceptor，sa site）、多嘧啶位点（poly-pyrimidinetract，ppt）和分支位点（branch site，bs），突变形式包括点突变、删除、插入或复杂突变（插入缺失），这些突变均会导致mrna在剪接过程中14号外显子随着两侧内含子区域的一端一同被剪切掉，13号外显子和15号外显子直接相连，由于e3泛素连接酶c-cbi不能与met蛋白相结合，减少了受体降解，并导致met介导的信号通路过度活化，从而推动肿瘤发生。met基因14号外显子跳跃突变是一项独立的预后不良指标。
2、目前市面上有关met基因14号外显子跳跃突变检出限标准品主要通过传统pcr技术扩增2kbp左右的met基因14号外显子缺失dna片段，体外转录为rna，再将其按不同比例混合到背景rna中，得到不同梯度的标准品。且目前使用的大部分met基因14号外显子跳跃突变检出限标准品主要都是根据每纳克多少突变拷贝数来制备，固定样本投入量的情况下，当样本突变拷贝数固定，突变频率较高时，突变能被检出，但
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了人met基因14号外显子跳跃突变核酸标准物质及应用。本专利技术提供的核酸标准物质以不同的每纳克突变拷贝数和不同突变频率混合配制，解决了以单维度制备标准品评价结果的局限性，为met基因14号外显子跳跃突变定性和定量测量方法的性能确认和验证及二代测序panel性能确认及验证等领域，提供了可靠的标准物质。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种met基因14号外显子跳跃突变的核酸标准物质，所述核酸标准物质为多组rna组合物；不同rna组合物中met基因14号外显子跳跃突变的拷贝数浓度和突变频率至少一项不同；每组rna组合物包括：背景基因组总rna、met野生型rna和met 14号外显子缺失型rna；
4、每组rna组合物中met基因14号外显子跳跃突变的拷贝数浓度=met 14号外显子缺失型rna的拷贝数/rna组合物的质量；
5、每组rna组合物中met基因14号外显子跳跃突变的突变频率=met 14号外显子缺失型rna的拷贝数/（背景基因组总rna中met野生型rna的拷贝数+met野生型rna的拷贝数+met14号外显子缺失型rna的拷贝数）×100%；
6、所述背景基因组总rna提取自无14号外显子跳跃突变的b淋巴细胞；
7、所述met野生型rna由含野生型met基因序列的重组质粒体外转录得到；
8、所述met 14号外显子缺失型rna由含突变型met基因序列的重组质粒体外转录得到，所述突变型met基因序列为野生型met基因14号外显子缺失的dna序列。
9、优选的，所述无14号外显子跳跃突变的b淋巴细胞包括gm12878细胞。
10、优选的，所述含野生型met基因序列的重组质粒或所述含突变型met基因序列的重组质粒的原始质粒包括pet-30a(+)质粒。
11、优选的，所述野生型met基因序列的基因id为nm_001127500.1。
12、优选的，所述突变型met基因序列为人工合成的dna序列。
13、本专利技术提供了上述技术方案所述核酸标准物质的制备方法，包括以下步骤：
14、将所述含野生型met基因序列的重组质粒酶切，得到含野生型met基因序列的线性化质粒dna；将所述含野生型met基因序列的线性化质粒dna进行体外转录，得到所述met野生型rna；
15、将所述含突变型met基因序列的重组质粒酶切，得到含突变型met基因序列的线性化质粒dna；将所述含突变型met基因序列的线性化质粒dna进行体外转录，得到所述met 14号外显子缺失型rna；
16、根据预设的核酸标准物质的拷贝数浓度和突变频率，将所述背景基因组总rna、met野生型rna和met 14号外显子缺失型rna按比例混合，得到所述核酸标准物质。
17、优选的，将所述背景基因组总rna、met野生型rna和met 14号外显子缺失型rna按比例混合后，将混合物进行均匀性评估、稳定性评估和定值；所述定值为标准值±扩展不确定度。
18、优选的，所述稳定性评估包括长期稳定性评估和短期稳定性评估。
19、本专利技术提供了上述技术方案所述核酸标准物质或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的核酸标准物质在制备检测met基因14号外显子跳跃突变的试剂盒中的应用。
20、本专利技术提供了一种检测met基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，包括上述技术方案所述核酸标准物质或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的核酸标准物质。
21、有益效果：
22、（1）本专利技术提供的核酸标准物质以不同的每纳克突变拷贝数（即具有met基因14号外显子跳跃突变不同拷贝数浓度）和不同突变频率混合配制，解决了以单维度制备标准品评价结果的局限性，检测结果更加准确，有利于各类产品、方法有关met 14跳突检出限的性能确认问题；
23、（2）正常人met基因表达量较低，难以混合出同时符合两个维度的标准品，本专利技术提供的核酸标准物质以含野生型met基因序列的重组质粒体外转录得到met野生型rna，以及以含突变型met基因序列的重组质粒体外转录得到met 14号外显子缺失型rna；再与背景rna混合，得到相应的突变拷贝数及突变频率，能更加准确的模拟体内发生的真实突变，尤其是有利于高通量测序结果的分析。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种MET基因14号外显子跳跃突变的核酸标准物质，其特征在于，所述核酸标准物质为多组RNA组合物；不同RNA组合物中MET基因14号外显子跳跃突变的拷贝数浓度和突变频率至少一项不同；每组RNA组合物包括：背景基因组总RNA、MET野生型RNA和MET 14号外显子缺失型RNA；
2.根据权利要求1所述的核酸标准物质，其特征在于，所述无14号外显子跳跃突变的B淋巴细胞包括GM12878细胞。
3.根据权利要求1所述的核酸标准物质，其特征在于，所述含野生型MET基因序列的重组质粒或所述含突变型MET基因序列的重组质粒的原始质粒包括pet-30a(+)质粒。
4.根据权利要求1或3所述的核酸标准物质，其特征在于，所述野生型MET基因序列的基因ID为NM_001127500.1。
5.根据权利要求1或3所述的核酸标准物质，其特征在于，所述突变型MET基因序列为人工合成的DNA序列。
6.权利要求1~5任一项所述核酸标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将所述
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述稳定性评估包括长期稳定性评估和短期稳定性评估。
9.权利要求1~5任一项所述核酸标准物质或利用权利要求6~8任一项所述制备方法制备得到的核酸标准物质在制备检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒中的应用。
10.一种检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~5任一项所述核酸标准物质或利用权利要求6~8任一项所述制备方法制备得到的核酸标准物质。
...【技术特征摘要】
1.一种met基因14号外显子跳跃突变的核酸标准物质，其特征在于，所述核酸标准物质为多组rna组合物；不同rna组合物中met基因14号外显子跳跃突变的拷贝数浓度和突变频率至少一项不同；每组rna组合物包括：背景基因组总rna、met野生型rna和met 14号外显子缺失型rna；
2.根据权利要求1所述的核酸标准物质，其特征在于，所述无14号外显子跳跃突变的b淋巴细胞包括gm12878细胞。
3.根据权利要求1所述的核酸标准物质，其特征在于，所述含野生型met基因序列的重组质粒或所述含突变型met基因序列的重组质粒的原始质粒包括pet-30a(+)质粒。
4.根据权利要求1或3所述的核酸标准物质，其特征在于，所述野生型met基因序列的基因id为nm_001127500.1。
5.根据权利要求1或3所述的核酸标准物质，其特征在于，所述突变型met基因序...
【专利技术属性】
技术研发人员：王冰，舒迎霜，商宇红，蔡丽丽，周启明，
申请(专利权)人：北京求臻医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。