一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和应用技术

本发明专利技术提供一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，用于检测待测样品中的目标基因序列，包括：S10、将反应液A和反应液B混合，得混合溶液；S20、将待测样品加入混合溶液中，孵育后，检测荧光信号，判断是否存在目标基因；反应液A包括扩增酶体系，反应液B包括gRNA组合物、Cas蛋白和信号探针，gRNA组合物包括至少一种非常规gRNA。本发明专利技术提供的技术方案中，通过采用非常规gRNA，调控Cas蛋白的顺式和反式切割活性，保持相对高反式切割活性，降低顺式切割活性，以调和检测过程中恒温扩增反应介导的靶基因扩增与CRISPR反应介导的靶基因耗竭的拮抗作用，实现核酸一步CRISPR检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测，特别涉及一种grna组合物及其crispr检测系统和应用。

技术介绍

1、crispr/cas系统是一种存在于大多数细菌和古菌中的适应性免疫系统，其利用编码在crispr位点中的引导rna（grna）指导crispr相关的内切酶（cas）识别和切割特定的外源核酸序列，以保护其免受病毒的感染。

2、最初，研究者在体外模拟crispr过程，利用特定的grna引导cas切割目标基因，从而实现目标靶基因的高效编辑。随后，研究者发现部分crispr/cas系统，如crispr/cas12，能在靶向切割目标dsdna（顺式切割）的同时，非特异地高效切割体系中的ssdna（反式切割）。这种特性促使crispr技术被迅速扩展到基因检测领域。在一个典型的crispr核酸检测应用中，通常利用前置核酸扩增技术（如重组酶聚合酶扩增，rpa）指数化放大痕量的目标核酸，随后利用grna/cas复合物特异性识别目标扩增子，从而激活其反式切割活性并裂解淬灭的寡核苷酸探针，释放可检测的荧光信号，实现对目标基因的特异性检测。然而，对于当前基于crispr的本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，用于检测待测样品中的目标基因序列，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述目标基因序列包括IS6110、IS1081、esxB、gryB、rpoB、katG、inhA、rpsL、rrs、gyrA、gyrB、embB、rfbE、eis或pncA等。

3.如权利要求1所述的基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述目标基因序列为IS6110；

4.如权利要求1所述的基于CRISPR/...

【技术特征摘要】

1.一种基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，用于检测待测样品中的目标基因序列，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述目标基因序列包括is6110、is1081、esxb、gryb、rpob、katg、inha、rpsl、rrs、gyra、gyrb、embb、rfbe、eis或pnca等。

3.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述目标基因序列为is6110；

4.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述grna组合物还包括至少一种常规grna；

5.如权利要求1所述的基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法，其特征在于，所述扩增酶体系包括扩增缓冲液、引物对、氯化镁和酶；和/或，

6.如权利要求5所述的基于crispr/cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄震，卢水华，宋喆，刘旭晖，徐鹏，王小敏，
申请(专利权)人：深圳市第三人民医院深圳市肝病研究所，
类型：发明
国别省市：