具有制造技术

本公开提供了具有区别结构域特征的核酸内切酶，以及使用此类酶或其变体的方法

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有RUVC结构域的酶
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求于
2021
年4月
30
日提交的标题为“具有
RUVC
结构域的酶
(ENZYMES WITH RUVC DOMAINS)”的美国临时申请第
63/182,438
号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中
。

技术介绍

[0003]Cas
酶以及其相关的成簇的规则间隔的短回文重复序列
(CRISPR)
向导核糖核酸
(RNA)
似乎是原核免疫系统的普遍组分
(
约
45
％的细菌，约
84
％的古细菌
)
，用于通过
CRISPR
‑
RNA
引导的核酸切割来保护此类微生物免受非自身核酸的侵害，如传染性病毒和质粒
。
虽然编码
CRISPR RNA
元件的脱氧核糖核酸
(DNA)
元件在结构和长度上可能相对保守，但其
CRISPR
相关
(Cas)
蛋白是高度多样化的，含有多种核酸相互作用结构域
。
虽然早在
1987
年就观察到
CRISPR DNA
元件，但
CRISPR/Cas
复合物的可编程核酸内切酶切割能力直到最近才被认识到，从而引起重组
CRISPR/Cas
系统在各种
DNA
操纵和基因编辑应用中的使用
。

技术实现思路

[0004]在一些方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，所述工程化核酸酶系统包括：
(a)
核酸内切酶，所述核酸内切酶被配置成与原间隔子相邻基序
(PAM)
序列结合，所述
PAM
序列包括
SEQ ID NO:550
‑
567
，其中所述核酸内切酶是2类
II
型
Cas
核酸内切酶；以及
(b)
工程化向导核糖核酸结构，所述工程化向导核糖核酸结构被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，所述核酸内切酶包括：
(i)
向导核糖核酸序列，所述向导核糖核酸序列被配置成与靶脱氧核糖核酸序列杂交；以及
(ii)tracr
核糖核酸序列，所述
tracr
核糖核酸序列被配置成与所述核酸内切酶结合
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶源自未培养的微生物
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶尚未被工程化为与不同的
PAM
序列结合
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶不是
Cas9
核酸内切酶
、Cas14
核酸内切酶
、Cas12a
核酸内切酶
、Cas12b
核酸内切酶
、Cas12c
核酸内切酶
、Cas12d
核酸内切酶
、Cas12e
核酸内切酶
、Cas13a
核酸内切酶
、Cas13b
核酸内切酶
、Cas13c
核酸内切酶或
Cas 13d
核酸内切酶
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶与
Cas9
核酸内切酶具有小于
80
％同一性
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶进一步包括
HNH
结构域
。
在一些实施例中，所述工程化向导核糖核酸结构包括至少两种核糖核酸多核苷酸
。
在一些实施例中，所述工程化向导核糖核酸结构包括一个核糖核酸多核苷酸，所述核糖核酸多核苷酸包括所述向导核糖核酸序列和所述
tracr
核糖核酸序列
。
在一些实施例中，所述向导核糖核酸序列与原核
、
细菌
、
古细菌
、
真核
、
真菌
、
植物
、
哺乳动物或人基因组序列互补
。
在一些实施例中，所述向导核糖核酸序列的长度为
15
‑
24
个核苷酸
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶包括接近所述核酸内切酶的
N
或
C
末端的一个或多个核定位序列
(NLS)。
在一些实施例中，所述
NLS
包括选自
SEQ ID NO:586
‑
601
的序列
。
在一些实施例中，所述工程化核酸酶系统进一步包括单链或双链
DNA
修复模板，所述单链或双链
DNA
修复模板从
5'
至
3'
包括：第一同源臂，所述第一同源臂包括位于所述靶脱氧核糖核酸序列的
5'
的至少
20
个核苷酸的序
列；至少
10
个核苷酸的合成
DNA
序列；以及第二同源臂，所述第二同源臂包括位于所述靶序列的
3'
的至少
20
个核苷酸的序列
。
在一些实施例中，所述第一同源臂或所述第二同源臂包括至少
40、80、120、150、200、300、500
或
1,000
个核苷酸的序列
。
在一些实施例中，所述系统进一步包括
Mg
2+
的来源
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶和所述
tracr
核糖核酸序列源自同一门内的不同细菌物种
。
在一些实施例中，所述核酸内切酶包括
SEQ ID NO:1
‑
549
或
602
‑
1276
或其与其具有至少
55
％同一性的变体
。
[0005]一方面，本公开提供了一种工程化核酸酶系统，所述工程化核酸酶系统包括：
(a)
核酸内切酶，所述核酸内切酶被配置成对包括
SEQ ID NO:550
‑
567
中的任一者的原间隔子相邻基序
(PAM)
序列具有选择性，其中所述核酸内切酶是2类
II
型
Cas
核酸内切酶
。
在一些实施例中，所述系统包括
(b)
工程化向导核酸结构，所述工程化向导核酸结构被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，所述工程化向导核酸结构包括：
(i)
靶向核酸序列，所述靶向核酸序列被配置成与靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种工程化核酸酶系统，其包括：
(a)
核酸内切酶，所述核酸内切酶被配置成对包括
SEQ ID NO:550
‑
567
中的任一者的原间隔子相邻基序
(PAM)
序列具有选择性，其中所述核酸内切酶是2类
II
型
Cas
核酸内切酶；以及
(b)
工程化向导核酸结构，所述工程化向导核酸结构被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，所述工程化向导核酸结构包括：
(i)
靶向核酸序列，所述靶向核酸序列被配置成与靶脱氧核糖核酸序列杂交；以及
(ii)tracr
核糖核酸序列，所述
tracr
核糖核酸序列被配置成与所述核酸内切酶结合
。2.
根据权利要求1所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶源自未培养的微生物
。3.
根据权利要求1或2所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶尚未被工程化以与和所述核酸内切酶的天然
PAM
序列不同的
PAM
序列结合
。4.
根据权利要求3所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶不是
Cas9
核酸内切酶
、Cas14
核酸内切酶
、Cas12a
核酸内切酶
、Cas12b
核酸内切酶
、Cas 12c
核酸内切酶
、Cas12d
核酸内切酶
、Cas12e
核酸内切酶
、Cas13a
核酸内切酶
、Cas13b
核酸内切酶
、Cas13c
核酸内切酶或
Cas 13d
核酸内切酶
。5.
根据权利要求3所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶与
Cas9
核酸内切酶具有小于
80
％同一性
。6.
根据权利要求1至5中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶进一步包括
PI
结构域，所述
PI
结构域包括与
SEQ ID NO:1277
‑
1641
或
1683
中的任一者具有至少
80
％同一性的序列或其变体，或者其中所述核酸内切酶进一步包括与
SEQ ID NO:1
‑
549
或
602
‑
1276
中的任一者的
PI
结构域具有至少
80
％同一性的
PI
结构域
。7.
根据权利要求6所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶进一步包括
PI
结构域，所述
PI
结构域包括与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者具有至少
80
％同一性的序列或其变体
。8.
根据权利要求6所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶进一步包括
PI
结构域，所述
PI
结构域包括与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者具有至少
80
％同一性的序列或其变体
。9.
根据权利要求1至8中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶进一步包括
RuvC
结构域
。10.
根据权利要求9所述的工程化核酸酶系统，其中所述
RuvC
结构域与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者的
RuvC
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。11.
根据权利要求
10
所述的工程化核酸酶系统，其中所述
RuvC
结构域与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者的
RuvC
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。12.
根据权利要求1至
11
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶进一步包括
HNH
结构域
。13.
根据权利要求
12
所述的工程化核酸酶系统，其中所述
HNH
结构域与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者的
HNH
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。14.
根据权利要求
12
所述的工程化核酸酶系统，其中所述
HNH
结构域与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者的
HNH
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。15.
根据权利要求1至
14
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶被配置成对包括
SEQ ID NO:553、555
或
566
中的任一者的
PAM
序列或其变体具有选择性
。16.
根据权利要求1至
15
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导核酸结构包括至少两个核糖核酸多核苷酸
。17.
根据权利要求1至
15
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导核酸结构包括一个核糖核酸多核苷酸，所述核糖核酸多核苷酸包括所述向导核糖核酸序列和所述
tracr
核糖核酸序列
。18.
根据权利要求1至
17
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:1645
‑
1662
中的任一者具有至少
80
％同一性的
tracr
序列，或者其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:568
‑
585
或
1643
‑
1644
中的任一者的非简并核苷酸具有至少
80
％同一性的序列
。19.
根据权利要求1至
17
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:1648、1650
或
1661
中的任一者具有至少
80
％同一性的
tracr
序列，或者其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:571、573
或
584
中的任一者的非简并核苷酸具有至少
80
％同一性的序列
。20.
根据权利要求1至
19
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述靶向核酸序列与原核
、
细菌
、
古细菌
、
真核
、
真菌
、
植物
、
哺乳动物或人基因组序列互补
。21.
根据权利要求1至
18
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述靶向核酸序列的长度为
15
‑
24
个核苷酸
。22.
根据权利要求1至
21
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶包括接近所述核酸内切酶的
N
或
C
末端的一个或多个核定位序列
(NLS)。23.
根据权利要求1至
22
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述
NLS
包括包含
SEQ ID NO:586
‑
601
中的任一者的序列或其变体
。24.
根据权利要求1至
23
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其进一步包括单链或双链
DNA
修复模板，所述单链或双链
DNA
修复模板从
5'
至
3'
包括：第一同源臂，所述第一同源臂包括位于所述靶脱氧核糖核酸序列的
5'
的至少
20
个核苷酸的序列；至少
10
个核苷酸的合成
DNA
序列；以及第二同源臂，所述第二同源臂包括位于所述靶序列的
3'
的至少
20
个核苷酸的序列
。25.
根据权利要求
24
所述的工程化核酸酶系统，其中所述第一同源臂或所述第二同源臂包括至少
40、80、120、150、200、300、500
或
1,000
个核苷酸的序列
。26.
根据权利要求1至
25
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述系统进一步包括
Mg
2+
的来源
。27.
根据权利要求1至
26
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶和所述
tracr
核糖核酸序列源自同一门内的不同细菌物种
。28.
根据权利要求1至
27
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶包括
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者或其与其具有至少
55
％同一性的变体
。29.
根据权利要求1至
28
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述序列同一性是通过
BLASTP、CLUSTALW、MUSCLE、MAFFT
算法或
CLUSTALW
算法使用史密斯
‑
沃特曼同源性搜索算法参数
(Smith
‑
Waterman homology search algorithm parameter)
来确定的
。30.
根据权利要求
29
所述的工程化核酸酶系统，其中所述序列同一性是通过所述
BLASTP
同源性搜索算法使用字长
(W)
为
3、
期望值
(E)
为
10
的参数以及
BLOSUM62
评分矩阵将空位罚分设置为存在
11
，扩展1并且使用条件组成评分矩阵调整来确定的
。31.
根据权利要求1至
30
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述
PAM
序列位于所述靶脱氧核糖核酸序列的
3'。32.
一种核酸，其包括为在生物体中表达而优化的工程化核酸序列，其中所述核酸编码2类
II
型
Cas
核酸内切酶，所述2类
II
型
Cas
核酸内切酶被配置成对包括
SEQ ID NO:550
‑
567
中的任一者的原间隔子相邻基序
(PAM)
具有选择性
。33.
根据权利要求
32
所述的核酸，其中所述核酸内切酶进一步包括
PI
结构域，所述
PI
结构域包括与
SEQ ID NO:1277
‑
1641
或
1683
中的任一者具有至少
80
％同一性的序列或其变体，或者其中所述核酸内切酶进一步包括与
SEQ ID NO:1
‑
549
或
602
‑
1276
中的任一者的
PI
结构域具有至少
80
％同一性的
PI
结构域
。34.
根据权利要求
32
所述的核酸，其中所述核酸内切酶进一步包括
PI
结构域，所述
PI
结构域包括与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者具有至少
80
％同一性的序列或其变体
。35.
根据权利要求
32
所述的核酸，其中所述核酸内切酶进一步包括
PI
结构域，所述
PI
结构域包括与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者具有至少
80
％同一性的序列或其变体
。36.
根据权利要求
32
至
35
中任一项所述的核酸，其中所述核酸内切酶进一步包括
RuvC
结构域
。37.
根据权利要求
36
所述的核酸，其中所述
RuvC
结构域与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者的
RuvC
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。38.
根据权利要求
36
所述的核酸，其中所述
RuvC
结构域与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者的
RuvC
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。39.
根据权利要求
32
至
38
中任一项所述的核酸，其中所述核酸内切酶进一步包括
HNH
结构域
。40.
根据权利要求
39
所述的核酸，其中所述
HNH
结构域与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者的
HNH
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。41.
根据权利要求
39
所述的核酸，其中所述
HNH
结构域与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者的
HNH
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。42.
根据权利要求
32
至
41
中任一项所述的核酸，其中所述核酸内切酶包括
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者或其与其具有至少
55
％同一性的变体
。43.
根据权利要求
32
至
42
中任一项所述的核酸，其中所述生物体是细菌
、
古细菌
、
真核
、
真菌
、
植物
、
哺乳动物或人生物体
。44.
一种工程化核酸酶系统，其包括：
(a)
核酸内切酶，所述核酸内切酶与
SEQ ID NO:1
‑
549、602
‑
1276
中的任一者或其变体具有至少
80
％序列同一性；以及
(b)
工程化向导核酸结构，其中所述工程化向导核酸结构被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且所述工程化向导核酸结构包括靶向核酸序列，所述靶向核酸序列被配置成与靶核酸序列杂交
。45.
根据权利要求
44
所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶包括
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者或其与其具有至少
55
％同一性的变体
。46.
根据权利要求
44
或
45
所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶进一步包括
RuvC
结构域
。47.
根据权利要求
46
所述的工程化核酸酶系统，其中所述
RuvC
结构域与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者的
RuvC
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。48.
根据权利要求
46
所述的工程化核酸酶系统，其中所述
RuvC
结构域与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者的
RuvC
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。49.
根据权利要求
44
至
48
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述核酸内切酶进一步包括
HNH
结构域
。50.
根据权利要求
44
至
49
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述
HNH
结构域与
SEQ ID NO:1、217、258、259、284、296、297、306、357、403、404、405、463、464、465、356
或
484
中的任一者的
HNH
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。51.
根据权利要求
44
至
49
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述
HNH
结构域与
SEQ ID NO:259、296
或
484
中的任一者的
HNH
结构域或其变体具有至少
80
％同一性
。52.
根据权利要求
44
至
51
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:1645
‑
1662
中的任一者具有至少
80
％同一性的
tracr
序列，或者其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:568
‑
585
或
1643
‑
1644
中的任一者的非简并核苷酸具有至少
80
％同一性的序列
。53.
根据权利要求
44
至
51
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:1648、1650
或
1661
中的任一者具有至少
80
％同一性的
tracr
序列，或者其中所述工程化向导核酸结构包括与
SEQ ID NO:571、573
或
584
中的任一者的非简并核苷酸具有至少
80
％同一性的序列
。54.
根据权利要求
44
至
53
中任一项所述的工程化核酸酶系统，其中所述工程化向导核酸结构被配置成与所述核酸内切酶形成复合物，并且包括：
(i)
靶向核酸序列，所述靶向核酸序列被配置成与靶脱氧核糖核酸序列杂交；以及
(ii)tracr
核糖核酸序列，所述
tracr
核糖核酸序列被配置成与所述核酸内切酶结合
。55.
根据权利要求
54
所述的工程化核酸酶系统，其中所述靶向核酸序列与细菌
、
古细菌
、
真核
、
真菌
、
植物
、
哺乳动物或人基因组序列互补
。56.
根据权利要求
54
或
55
所述的工程化核酸酶系统，其中所述靶向核酸序列的长度为
15
‑
24
个核苷酸
。57.
一种工程化核酸酶系统，其包括：
(a)
工程化向导核酸结构，所述工程化向导核酸结构包括：
(i)
与
SEQ ID NO:1645
‑
1662
中的任一者具有至少
80
％同一性的
tracr
序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩，
申请(专利权)人：宏基因组学公司，
类型：发明
国别省市：