一种突变的核糖核酸酶制造技术

本发明专利技术提供一种突变的核糖核酸酶

【技术实现步骤摘要】
一种突变的核糖核酸酶R及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程以及医药领域，特别涉及核糖核酸酶
R
领域，尤其是突变的核糖核酸酶
R
及其应用
。
本案是申请号为
202211610204.8
，专利技术名称为“一种突变的核糖核酸酶
R
及其应用”的分案申请
。

技术介绍

[0002]核糖核酸酶
R(RNase R)
是一种依赖镁的
3'
→
5'
外核糖核酸酶，其基本上消化所有线性
RNA
，但不消化套索状或环状
RNA
结构，或比
3'
突出端短的双链
RNA 7
个核苷酸
。
大多数细胞
RNA
会被
RNase R
完全消化，但
tRNA
，
5S RNA
和内含套索蛋白除外
。
套索的
3'
‑
尾巴将被
RNase R
修饰为分支点核苷酸，其中存在
2'
，
5'
‑
磷酸二酯键
。
[0003]环状
RNA(Circular RNA
，
circRNA)
是区别于线性
RNA
的一类新型环状非编码
RNA
，半衰期长，具有物种保守性和组织特异性
>。
其独特的环状结构使其不容易被
RNA
酶降解，因此在细胞内稳定性很强，在新型生物标记
、
生物学机制研究等方向具有巨大的潜力和研究价值
。
[0004]“circRNA”这一概念最早出现在
1971
年，在
RNA
病毒中被发现，但长期以来，由于其表达丰度很低，所以一直被认为是转录的“噪音”，没有实际作用
。
直到
2012
年，借助于高通量测序技术，
Salzman
等
(Salzman J,Gawad C,Wang P L,et al.Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.Plos One,2012,7(2):1
‑
12)
研究发现无论是白血病细胞
、Hela
细胞系还是正常人原代血细胞均存在通过外显子重排形成非线性的环状转录物现象，约
80
个环状
RNA
被首次报道
。
后续大量的研究者涌入这个领域，不断产出环状
RNA
的研究成果
。
目前研究最多的就是位于细胞质中的外显子形成的环状
RNA
，其含有大量
miRNA
结合位点，可起到
miRNA
海绵作用，结合并封闭
miRNA
的调控作用，从而使靶基因表达增强
。
[0005]随着环状
RNA
的深入研究，环状
RNA
制备问题就越来越备受关注
。
在环状
RNA
制备过程中，为了消除其他
RNA
的干扰，必须要用到
RNase R
对反应体系的其他
RNA
进行消除，才能获得较纯的
circRNA。
但是，目前已有的
RNase R
品质差别较大，在验证过程中发现某些
RNase R
对
circRNA
有明显的降解作用
。
随着对环状
RNA
研究的热度不断增加，未来市场和研究领域对于
RNase R
的需求会进一步增加
。
[0006]CN114438054A(
公开日期
2022.05.06)
公开了一种突变型
RNase R
被命名为
RNase R_
△
M8
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
所示
。
该专利技术提供的突变型
RNase R_
△
M8
的制备过程包括载体构建
、
载体转化
、
蛋白诱导表达
、
细菌收集
、
蛋白纯化及活性测定等过程
。
与野生型
RNase R
相比，该专利技术提供的突变型
RNase R
的蛋白表达量更高，可以耐受
150mM
的
NaCl。
[0007]虽然现有技术中已有突变型
RNase R
，但本领域仍然存在亟需提供不同的
、
性能提升的突变的
RNase R
用于工业和科学研究，特别是酶活性提升的突变的
RNase R
，可获得产量和纯度更高的
circRNA。

技术实现思路

[0008]针对
RNase R
领域现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种性能提升的，特别是酶活相对于亲本显著提升的突变的
RNase R。
本专利技术进一步的目的是提供一种高表达核糖核酸酶
RNase R
的重组菌株，特别是重组大肠杆菌，用于实现
RNase R
突变体的高效生产，具有良好的工业应用前景
。
本专利技术还提供了编码所述突变的
RNase R
的重组核酸，包含所述核酸的表达盒
、
载体
、
细胞
、
菌株
、
组合物
、
试剂盒，以及
RNase R
突变体的制备方法
、
纯化方法
、
酶活检测方法，还有其在降解线性
RNA、
生产
circRNA
领域的应用等
。
[0009]本专利技术的一方面提供一种突变的核糖核酸酶
R
，其特征在于，在亲本核糖核酸酶
R
的基础上包含突变，所述突变包含
T495E
，
A246E
，
K457F
，
A246F
，
D281F
，或
D122L
，所述亲本核糖核酸酶
R
的氨基酸序列如
SEQ I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种突变的核糖核酸酶
R
，其特征在于，在亲本核糖核酸酶
R
的基础上包含突变，所述突变为
D281F
，所述亲本核糖核酸酶
R
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:1
所示
。2.
根据权利要求1所述的突变的核糖核酸酶
R
，其特征在于，所述突变的核糖核酸酶
R
为突变体
D281F
，所述突变体
D281F
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:27
所示
。3.
根据权利要求1或2所述的突变的核糖核酸酶
R
，其特征在于，所述亲本核糖核酸酶
R
的
DNA
序列如
SEQ ID NO.2
所示
。4.
一种重组核酸，其特征在于，包含编码权利要求1‑3任一项所述突变的核糖核酸酶
R
的核酸
。5.
一种表达盒，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸
。6.
一种载体，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸
、
或权利要求5所述的表达盒
。7.
根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体为表达载体
。8.
一种细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸
、
或权利要求5所述的表达盒
、
或权利要求6或7所述的载体
。9.
一种重组菌，其特征在于，包含权利要求4所述的重组核酸
、
或权利要求5所述的表达盒
、
或权利要求6或7所述的载体
。10.
根据权利要求9所述的重组菌，其特征在于，所述菌为大肠杆菌
。11.
根据权利要求
10
所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为
E.coli BL21(DE3)、E.coli Origami B(DE3)
或
E.coli Rosetta Blue(DE3)
中的一种
。12.
根据权利要求
11
所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为
E.coli BL21(DE3)。13.
一种组合物，其特征在于，包含权利要求1‑3任一项所述突变的核糖核酸酶
R、
或权利要求4所述的重组核酸
、
或权利要求5所述的表达盒
、
或权利要求6或7所述的载体
、
或权利要求8所述的细胞
、
或权利要求9‑
12
任一项所述的重组菌
。14.
一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1‑3任一项所述突变的核糖核酸酶
R、
或权利要求4所述的重组核酸
、
或权利要求5所述的表达盒
、
或权利要求6或7所述的载体
、
或权利要求8所述的细胞
、
或权利要求9‑
12
任一项所述的重组菌
、
或权利要求
13
所述的组合物
。15.
一种制备权利要求1‑3任一项所述突变的核糖核酸酶
R
的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
构建含有编码所述突变的核糖核酸酶

【专利技术属性】
技术研发人员：左涛，刘立，汪芸，王鹏源，王满朝，
申请(专利权)人：江苏耀海生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：