一种快速筛选大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种快速筛选大分子量人员胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法，其包括如下步骤：毕赤酵母表达人源胶原蛋白、培养单克隆、高效毕赤酵母转化、简单快速挑选毕赤酵母工程菌高拷贝菌株的方法。本发明专利技术过程简单高效，节省获得高表达大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌株所需要的时间、人力、物力等支出，大大提高实验效率；同时，本方法适用于筛选高表达人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌株，但是不局限于高表达人源胶原蛋白毕赤酵母菌株的筛选。表达人源胶原蛋白毕赤酵母菌株的筛选。表达人源胶原蛋白毕赤酵母菌株的筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物工程和医药工程
，具体涉及到一种快速筛选大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法及应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白广泛应用于生物、美容、食品保健等领域，并在医药材料领域具有巨大的应用前景，特别是在医疗领域的应用，如在烧伤治疗、创伤治疗、止血、眼科治疗和口腔科治中，发挥非常重要的作用，同时，国外已经开始将胶原蛋白作为支架材料用于构建器官。但限制胶原蛋白应用最大的问题是胶原蛋白的来源。
[0003]目前胶原蛋白主要两大来源，一是动物来源，主要从畜禽动物组织及海洋生物(畜禽骨头、猪皮、海参、鱼鳞、鱼皮)中提取天然胶原蛋白及胶原肽，虽然过程简便，但是存在问题：1)胶原蛋白提取效率较低，且提取的胶原蛋白分子量一般不高，同时含有较多杂质。2)受到提取工艺的限制，提取的胶原蛋白分子量在500Da以上，再小的胶原蛋白很难提取出来。3)不同提取工艺尤其是酸法、碱法提取胶原蛋白时，会对环境造成污染，无法完全达到绿色提取。提取的胶原蛋白存在免疫原性与病原体污染的问题，多用于化妆品、食品领域。另一种获取胶原蛋白是通过微生物发酵获得。和直接提取相比具有很多优势：1)产品安全，生产过程可控。原料相对明确，成分清晰，减少了病毒感染等污染风险。2)产品质量稳定，批次重复性好。采用基因工程技术表达特定的胶原蛋白分子，其成分单一，且菌株稳定性好，生产批次间差异小，产品质量稳定。3)生物相容性好，减少不必要的免疫反应。4)微生物发酵发获取胶原蛋白生产周期相对较短，生产成本相对较低。
[0004]在毕赤酵母中表达外源基因工程产物，筛选高表达的毕赤酵母工程菌是个必不可少的实验环节，对于筛选外源蛋白的高效表达工程菌，通常有用传统的摇瓶诱导表达筛选，验证外源蛋白表达的产量。如果利用传统的摇瓶诱导表达筛选法，那么每次就要对成千上万的转化子进行鉴定，先对每个转化子进行初步筛选，即先将每个转化子都进行摇瓶(一般为4
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6天)，中间更换为诱导培养基，然后定时添加甲醇或其他诱导剂诱导外源蛋白高效表达，然后再取发酵液，利用SDS
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PAGE对发酵液的外源蛋白的表达量进行鉴定，最后将每次筛选得到外源蛋白表达量相对较高工程菌，再来进行复筛，这样要消耗大量的人力和物力。所以说，获得一株高效筛选表达菌株的方法，对于提高工作效率，缩短筛选时间是十分重要的。

技术实现思路

[0005]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0006]鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0007]因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种快速筛选大分子量人员胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种快速筛选大分子量人员胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法及应用，其包括如下步骤：毕赤酵母表达人源胶原蛋白：
[0009]利用毕赤酵母高效表达人源胶原蛋白；提取原始质粒，扩增质粒后，提取原始质粒，对于原始质粒进行酶切制得线性化原始质粒；
[0010]培养单克隆：使用受体菌在平板上划线置于恒温培养箱中，恒温培养至长出分散的单克隆菌落；挑取单克隆菌落接入培养基，恒温且在200
‑
220rpm培养；挑取单克隆菌落接入培养基中，恒温且在200
‑
220rpm培养；挑取单克隆菌落接入培养基，恒温且在200
‑
220rpm培养；培养物接入新鲜培养基中，恒温且在200
‑
220rpm培养至OD600＝1.3
‑
1.5；将培养物在4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以100mL预冷无菌水重悬细胞；然后4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以100mL预冷无菌水重悬细胞，接着在4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以10mL预冷LiAc制备液重悬细胞，4℃静置30分钟；4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以4mL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞；4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以2mL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞；4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以1mL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞；4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以100μL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞，制得感受态细胞，分装感受态细胞，每份80μL，冰上保存，待用于后续电转化实验；
[0011]高效毕赤酵母转化：将培养单克隆中制得的感受态细胞加入预冷的线性化重组质粒，混匀后冰浴，然后转移至预冷的电转杯内，电转杯置入电转仪。电转仪参数设置为Pichia Pastoris预设，电击1次后立即冰浴冷却30秒，电击5
‑
10次；完成后将溶液加入1到mL预冷1M山梨醇溶液，轻轻吹打均匀，将内容物转移至无菌离心管中；选择转速为1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去部分上清，菌液重悬细胞，30℃恒温培养；然后将细胞悬液涂布在选择性抗生素的培养基上；室温静止至平板上无显著流动液体，转移至恒温培养箱，25
‑
30℃倒置培养至含有选择性抗生素的培养基长出明显的单克隆菌落；
[0012]简单快速挑选毕赤酵母工程菌高拷贝菌株的方法：挑取转化后在低浓度选择性抗生素的平板长出明显的单克隆菌落，对单克隆进行编号，同时将其转移到按照梯度浓度进行设置的选择性抗生素培养基上，并做好标记；将转板后的平板恒温倒置培养24
‑
48h，平板长出明显的单克隆菌落；记录在不同抗生素浓度平板上生长菌落的序号，挑取不同抗生素浓度上生长的单克隆菌株进行表达验证。
[0013]作为本专利技术所述的快速筛选大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法的一种优选方案，其中：受体菌为P.Pastoris X
‑
33甘油菌。
[0014]作为本专利技术所述的快速筛选大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法的一种优选方案，其中：恒温为保持温度在25～30℃。
[0015]作为本专利技术所述的快速筛选大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法的一种优选方案，其中：培养基为YPD培养基。
[0016]作为本专利技术所述的快速筛选大分子量人源胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法的一种优选方案，其中：选择性抗生素为Zeocin。
[0017]作为本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选大分子量人员胶原蛋白毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：毕赤酵母表达人源胶原蛋白：利用毕赤酵母高效表达人源胶原蛋白；提取原始质粒，扩增质粒后，提取原始质粒，对于原始质粒进行酶切制得线性化原始质粒；培养单克隆：使用受体菌在平板上划线置于恒温培养箱中，恒温培养至长出分散的单克隆菌落；挑取单克隆菌落接入培养基，恒温且在200
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220rpm培养；挑取单克隆菌落接入培养基中，恒温且在200
‑
220rpm培养；挑取单克隆菌落接入培养基，恒温且在200
‑
220rpm培养；培养物接入新鲜培养基中，恒温且在200
‑
220rpm培养至OD600＝1.3
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1.5；将培养物在4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以100mL预冷无菌水重悬细胞；然后4℃、1500
‑
2000
×
g离心5分钟，去上清，以100mL预冷无菌水重悬细胞，接着在4℃、1500
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2000
×
g离心5分钟，去上清，以10mL预冷LiAc制备液重悬细胞，4℃静置30分钟；4℃、1500
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×
g离心5分钟，去上清，以4mL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞；4℃、1500
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2000
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g离心5分钟，去上清，以2mL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞；4℃、1500
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2000
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g离心5分钟，去上清，以1mL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞；4℃、1500
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2000
×
g离心5分钟，去上清，以100μL预冷1M山梨醇溶液重悬细胞，制得感受态细胞，分装感受态细胞，每份80μL，冰上保存，待用于后续电转化实验；高效毕赤酵母转化：将培养单克隆中制得的感受态细胞加入预冷的线性化重组质粒，混匀后冰浴，然后转移至预冷的电转杯内，电转杯置入电转仪。电转仪参数设置为Pichia Pastoris预设，电击1次后立即冰浴冷却30秒，电击...

【专利技术属性】
技术研发人员：左涛，刘立，汪芸，王鹏源，王满朝，
申请(专利权)人：江苏耀海生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：