一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用。根据疏水性，对人天然Ⅲ型胶原蛋白进行改造，人为筛选设计获得类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1

【技术实现步骤摘要】
一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及医药工程领域，特别是医美原料领域，具体涉及一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白广泛应用于生物、美容、食品保健等领域，并在医药材料领域具有巨大的应用前景，特别是在医疗领域的应用，如在烧伤治疗、创伤治疗、止血、眼科治疗和口腔科治中，发挥非常重要的作用，同时，国外已经开始将胶原蛋白作为支架材料用于构建器官。但限制胶原蛋白应用最大的问题是胶原蛋白的来源。
[0003]目前胶原蛋白主要两大来源，一是动物来源，主要从畜禽动物组织及海洋生物（畜禽骨头、猪皮、海参、鱼鳞、鱼皮）中提取天然胶原蛋白及胶原肽，虽然过程简便，但是存在问题：1）胶原蛋白提取效率较低，且提取的胶原蛋白分子量一般不高，同时含有较多杂质。2）受到提取工艺的限制，提取的胶原蛋白分子量在500 Da以上，再小的胶原蛋白很难提取出来。3）不同提取工艺尤其是酸法、碱法提取胶原蛋白时，会对环境造成污染，无法完全达到绿色提取。提取的胶原蛋白存在免疫原性与病原体污染的问题，多用于化妆品、食品领域。另一种获取胶原蛋白是通过微生物发酵获得。和直接提取相比具有很多优势：1）产品安全，生产过程可控。原料相对明确，成分清晰，减少了病毒感染等污染风险。2）产品质量稳定，批次重复性好。采用基因工程技术表达特定的胶原蛋白分子，其成分单一，且菌株稳定性好，生产批次间差异小，产品质量稳定。3）生物相容性好，减少不必要的免疫反应。4）微生物发酵发获取胶原蛋白生产周期相对较短，生产成本相对较低。/>[0004]目前，虽然通过动物组织提取胶原是最主要的手段，成本也较低，但是通过该方法获得的胶原蛋白一般水溶性较差、具有潜在的病毒传染性风险、免疫原性较高、胶原产品质量控制难度高等缺点。通过基因工程的手段制备类人源胶原蛋白分子则可以规避这些缺点，但是天然的胶原蛋白分子过大，无法或很难通过基因工程手段直接生产，而通过生产与天然胶原蛋白序列相似、分子量更小的类人源胶原蛋白分子则是在技术上更为可行。
[0005]现有技术公开了不同的重组胶原蛋白以及应用等，专利文献1（CN100391974C，公开/公告日期2008
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04）公开了一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法，该重组胶原蛋白氨基酸序列的主体为Gly
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Xaa
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Yaa的三联体，其中Xaa和Yaa中至少有一个带电氨基酸残基；其N末端或C末端包含半胱氨酸残基的序列；在整个氨基酸序列中包含有Arg
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Gly
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Asp残基组合。专利文献2（CN102351954B，公开/公告日期2013
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18）公开了一种重组胶原蛋白，其特定的氨基酸序列组成，还公开了包含该重组胶原蛋白的敷料，特别是面膜巾。专利文献3（CN107090458A，公开/公告日期2017
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25）公开了一种酵母重组胶原蛋白的生产方法，包括重组毕赤酵母工程菌构建及其无需甲醇诱导的组成型分泌表达重组胶原蛋白的方法，首先在基因水平上利用毕赤酵母惯用密码子优化胶原基因序列并人工全基因合成，然后整合进酵母染色体中，构建成组成型分泌表达的重组毕赤酵母工程菌。然而，上述现有技术的重组胶原蛋白仍存在水溶性不足、保湿性效果一般等功能缺陷。
[0006]虽然，现阶段市场上已有一些重组胶原蛋白产品，然而现有的产品都是针对各自产品特点需要，在人胶原蛋白序列的基础上进行重新构建设计的，但这些设计并不能满足胶原蛋白产品极大的水溶性和亲水性、良好的保湿性和吸湿性等特殊性能需求，同时还满足产业化制备的需要。因此，本领域亟需提供一种水溶性和亲水性、保湿性和吸湿性效果优异的重组胶原蛋白产品，且制备工艺可达到工业化大规模生产，获得的产品可满足医美类等化妆品领域的高标准。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术的目的之一是提供一种人为筛选设计的重组胶原蛋白产品，该产品具有优异的水溶性和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且有促进细胞增殖、修复和抗皱紧致功效。本专利技术还提供所述重组胶原蛋白的串联蛋白和组合物，特别是冻干粉，编码其的核酸，包含所述核酸的载体，特别是酵母载体，包含所述核酸和载体的重组宿主细胞，特别是酵母宿主细胞。本专利技术还提供发酵表达、纯化所述胶原蛋白的方法，制备冻干粉的方法，以及在制备功能性化妆品或医美类化妆品及医用敷料中的应用。本专利技术提供的生产、纯化、制备方法，可实现低成本的工业化生产。
[0008]本专利技术进一步提供一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，命名为COL3A1
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QS
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1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]本专利技术的一方面，提供一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白串联蛋白，其特征在于，所述串联蛋白的氨基酸序列由N个核心单元进行重复串联形成，其中N是大于1的自然数，所述核心单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]进一步地，所述N选择2
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5中的任一个数值。
[0011]本专利技术的另一方面提供一种分离的核酸，其特征在于，编码所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白或所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白串联蛋白。
[0012]进一步地，编码所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0013]本专利技术的另一方面提供一种重组载体，其特征在于，包含所述的核酸。
[0014]进一步地，所述载体为酵母系统表达载体。
[0015]进一步地，所述酵母系统表达载体为pPICZα A载体或其他酵母载体，其他酵母载体包含pPIC9，pPIC9K，pHIL
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S1，或pYAM75P载体。
[0016]本专利技术的另一方面提供一种重组宿主细胞，其特征在于，包含所述的核酸或所述的重组载体。
[0017]进一步地，所述重组宿主细胞为酵母。
[0018]进一步地，所述酵母为毕赤酵母X33，GS115，SMD1168或其他酵母菌株，其他酵母包含KM71或KM71H菌株等。
[0019]本专利技术的另一方面提供一种组合物，其特征在于，包含所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白或所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白串联蛋白。
[0020]进一步地，所述组合物为冻干粉。
[0021]本专利技术的另一方面提供一种发酵表达制备所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包含如下步骤：(1)种子培养；
(2)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐培养，控制适合的DO、搅拌转速、通气量、温度，在适合的生长阶段开始流加、诱导表达；(3)发酵上清的制备：培养至适合的时间结束培养，取发酵液去除菌体，过滤，获得发酵上清液。
[0022]本专利技术的另一方面提供一种纯化所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包含将所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，命名为COL3A1
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QS
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1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的串联蛋白，其特征在于，所述串联蛋白的氨基酸序列由N个核心单元进行重复串联形成，其中N是大于1的自然数，所述核心单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求2所述的串联蛋白，其特征在于，所述N选择2
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5中的任一个数值。4.一种分离的核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白或权利要求2或3所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的串联蛋白。5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述载体为酵母系统表达载体。7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述酵母系统表达载体为pPICZα A，pPIC9，pPIC9K，pHIL
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S1，或pYAM75P载体。8.一种重组宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的核酸或权利要求5
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7任一项所述的重组载体。9.根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为酵母。10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：左涛，刘立，公少华，王鹏源，王满朝，
申请(专利权)人：江苏耀海生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：