一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。所述方法包括如下步骤：敲除圆红冬孢酵母中CAR2基因且异源表达伸长盐单胞菌来源的ectB、ectA和ectC基因；进一步的，所述方法还包括过表达L

【技术实现步骤摘要】
一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]圆红冬孢酵母是一种在生物制造中具有巨大应用潜力的真核生物，可高效利用秸秆木质纤维素水解液等多种碳源，常用于高产油脂类化合物和萜类化合物等，高产其他化合物的应用潜力亟待挖掘。
[0003]依克多因(ectoine)又称作四氢甲基嘧啶羧酸，是一种存在于多种细菌中的天然氨基酸衍生物，具有帮助这些细菌耐受高盐、高温、高紫外线辐射等极端环境的作用。依克多因可作为高端化妆品原料使用，具有很高经济价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供高产依克多因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。
[0005]第一方面，本专利技术保护一种重组菌的构建方法。
[0006]本专利技术保护的重组菌的构建方法包括如下步骤：降低圆红冬孢酵母中CAR2蛋白的含量和/或活性，且提高所述圆红冬孢酵母中伸长盐单胞菌来源的EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白的含量和/或活性；
[0007]所述EctB蛋白为A1)或A2)所示的蛋白质：
[0008]A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009]A2)由序列表中序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctB蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质；
[0010]所述EctA蛋白为B1)或B2)所示的蛋白质：
[0011]B1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012]B2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctA蛋白活性的由B1)衍生的蛋白质；
[0013]所述EctC蛋白为C1)或C2)所示的蛋白质：
[0014]C1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0015]C2)由序列表中序列5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctC蛋白活性的由C1)衍生的蛋白质；
[0016]所述CAR2蛋白为D1)或D2)所示的蛋白质：
[0017]D1)由序列表中序列24所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0018]D2)由序列表中序列24所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有CAR2蛋白活性的由D1)衍生的蛋白质。
[0019]进一步的，所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中L
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谷氨酸脱氢酶GDH2的含量
和/或活性的步骤。
[0020]所述L
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谷氨酸脱氢酶GDH2为E1)或E2)所示的蛋白质：
[0021]E1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0022]E2)由序列表中序列11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L
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谷氨酸脱氢酶GDH2活性的由E1)衍生的蛋白质。
[0023]更进一步的，所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC和/或L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2和/或L
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天冬氨酸4
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磷酸转移酶HOM3的含量和/或活性的步骤。
[0024]所述丙酮酸羧化酶PYC为F1)或F2)所示的蛋白质：
[0025]F1)由序列表中序列14所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0026]F2)由序列表中序列14所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸羧化酶PYC活性的由F1)衍生的蛋白质。
[0027]所述L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2为G1)或G2)所示的蛋白质：
[0028]G1)由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0029]GF2)由序列表中序列18所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2活性的由G1)衍生的蛋白质。
[0030]所述L
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天冬氨酸4
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磷酸转移酶HOM3为H1)或H2)所示的蛋白质：
[0031]H1)由序列表中序列21所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0032]H2)由序列表中序列21所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L
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天冬氨酸4
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磷酸转移酶HOM3活性的由H1)衍生的蛋白质。
[0033]上述方法中，所述CAR2蛋白的编码基因序列如序列表中序列25所示。
[0034]所述EctB蛋白的编码基因序列如序列表中序列2所示。
[0035]所述EctA蛋白的编码基因序列如序列表中序列4所示。
[0036]所述EctC蛋白的编码基因序列如序列表中序列6所示。
[0037]所述L
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谷氨酸脱氢酶GDH2的编码基因序列如序列表中序列12所示。
[0038]所述圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC的编码基因序列如序列表中序列15所示。
[0039]所述L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2的编码基因序列如序列表中序列19所示。
[0040]所述L
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天冬氨酸4
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磷酸转移酶HOM3的编码基因序列如序列表中序列22所示。
[0041]上述方法中，所述降低圆红冬孢酵母中的CAR2蛋白的含量和/或活性的方法为将圆红冬孢酵母中的CAR2基因敲除。
[0042]所述提高圆红冬孢酵母中伸长盐单胞菌来源的EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白的含量和/或活性的方法为将提高ectB、ectA和ectC基因表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
[0043]所述提高圆红冬孢酵母中L
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谷氨酸脱氢酶GDH2的含量和/或活性的方法为将提高L
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谷氨酸脱氢酶基因GDH2表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
[0044]所述提高圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC的含量和/或活性的方法为将提高丙酮酸羧化酶基因PYC表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
[0045]所述提高圆红冬孢酵母中L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2的含量和/或活性
的方法为将提高L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶基因AAT2表达量的物质导入圆红冬孢酵母中。
[0046]所述提高所述圆红冬孢酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产依克多因重组菌的构建方法，包括如下步骤：降低圆红冬孢酵母中CAR2蛋白的含量和/或活性，且提高所述圆红冬孢酵母中伸长盐单胞菌来源的EctB蛋白、EctA蛋白和EctC蛋白的含量和/或活性；所述EctB蛋白为A1)或A2)所示的蛋白质：A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)由序列表中序列1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctB蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质；所述EctA蛋白为B1)或B2)所示的蛋白质：B1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctA蛋白活性的由B1)衍生的蛋白质；所述EctC蛋白为C1)或C2)所示的蛋白质：C1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；C2)由序列表中序列5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有EctC蛋白活性的由C1)衍生的蛋白质；所述CAR2蛋白为D1)或D2)所示的蛋白质：D1)由序列表中序列24所示的氨基酸序列组成的蛋白质；D2)由序列表中序列24所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有CAR2蛋白活性的由D1)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中L
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谷氨酸脱氢酶GDH2的含量和/或活性的步骤；所述L
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谷氨酸脱氢酶GDH2为E1)或E2)所示的蛋白质：E1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列组成的蛋白质；E2)由序列表中序列11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L
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谷氨酸脱氢酶GDH2活性的由E1)衍生的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中丙酮酸羧化酶PYC的含量和/或活性的步骤；所述丙酮酸羧化酶PYC为F1)或F2)所示的蛋白质：F1)由序列表中序列14所示的氨基酸序列组成的蛋白质；F2)由序列表中序列14所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸羧化酶PYC活性的由F1)衍生的蛋白质。4.根据权利要求1
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3任一所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2的含量和/或活性的步骤；所述L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2为G1)或G2)所示的蛋白质：G1)由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质；G2)由序列表中序列18所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有L
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天冬氨酸:2
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酮戊二酸转氨酶AAT2活性的由G1)衍生的蛋白质。5.根据权利要求1
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4任一所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括提高所述圆红冬孢酵母中L
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天冬氨酸4
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磷酸转移酶HOM3的含量和/或活性的步骤；
所述L
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天冬氨酸4
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磷酸转移酶HOM3为H1)或H2)所示的蛋白质：H1)由序列表中序列21所示的氨基酸序列组成的蛋白质；H2)由序列表中序列21所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜浩，刘锋，庄满生，
申请(专利权)人：合曜生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：