一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌的构建方法及其应用。本发明专利技术通过在圆红冬孢酵母中异源表达粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶编码基因Ncegt1和Ncegt2，以及酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶编码基因MET14，同时弱化脂肪酸合成途径关键基因ACC1，最终构建得到高效生产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌株。通过实验证明：该菌株以葡萄糖为唯一碳源，在5L发酵罐中培养72h，麦角硫因的产量可达6.2g/L。对于麦角硫因工业生产来说，本发明专利技术构建的高效生产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌株将产生巨大的经济效益，具有重大的推广应用价值。价值。

【技术实现步骤摘要】
一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种高效生产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌株的构建方法及其应用，特别涉及一种异源表达粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2和酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶基因MET14，且弱化脂肪酸合成途径关键基因ACC1的圆红冬孢酵母工程菌株及其在发酵生产麦角硫因中的应用。

技术介绍

[0002]麦角硫因(Ergothioneine，EGT)是在麦角真菌中发现的含硫氨基酸，在液体中，EGT以硫酮和硫醇的形式存在，在中性或碱性环境中以硫酮为主，是一种珍贵并且有效的抗氧化剂，在改善神经退行性疾病和心血管疾病方面具有巨大的潜力。麦角硫因在其他生物中也可以合成，如粗糙脉孢菌、分枝杆菌和丝状真菌等少量微生物，但产量最高的只有2mg/L。
[0003]麦角硫因的生产方法有化学合成法、提取法和微生物合成法。由于化学合成法和提取法成本高和工艺复杂，因此微生物发酵生产麦角硫因更受研究者青睐。在自然界中，EGT通过两种不同的途径产生：细菌途径和真菌途径。这两种途径都使用S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)，使用egtD编码的麦角硫因生物合成甲基转移酶或Egt1编码的麦角硫因生物合成蛋白1将组氨酸甲基化三次，形成组氨酸甜菜碱。在真菌途径中，组氨酸被Egt1甲基化3次以形成海西氨酸，然后相同的酶连接半胱氨酸生成海西半胱氨酸亚砜，再经β
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裂解酶Egt2将丙酮酸铵与中间体分离，随后硫的还原产生EGT。与细菌相比，这种真菌途径只涉及两种酶，而且不需要γ
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谷氨酰
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半胱氨酸参与反应，因此在一定程度上消除了EGT与谷胱甘肽之间的生物合成竞争，故而比细菌途径更有效。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供高产麦角硫因的圆红冬孢酵母工程菌及其构建方法与应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种产麦角硫因重组菌的构建方法。
[0006]本专利技术提供的产麦角硫因重组菌的构建方法包括如下步骤：提高圆红冬孢酵母中粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2的含量和/或活性；且提高所述圆红冬孢酵母中酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶MET14的含量和/或活性，且降低所述圆红冬孢酵母中脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的含量和/或活性。
[0007]进一步的，所述麦角硫因合成酶Ncegt1为A1)或A2)所示的蛋白质：
[0008]A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009]A2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt1活性的由A1)衍生的蛋白质；
[0010]所述麦角硫因合成酶Ncegt1的编码基因为a1)或a2)所示的DNA分子：
[0011]a1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0012]a2)与a1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt1的DNA分子。
[0013]所述麦角硫因合成酶Ncegt2为B1)或B2)所示的蛋白质：
[0014]B1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0015]B2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt2活性的由B1)衍生的蛋白质；
[0016]所述麦角硫因合成酶Ncegt2的编码基因为b1)或b2)所示的DNA分子：
[0017]b1)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0018]b2)与b1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt2的DNA分子。
[0019]所述ATP硫酸化酶MET14为C1)或C2)所示的蛋白质：
[0020]C1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0021]C2)由序列表中序列9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有ATP硫酸化酶MET14活性的由C1)衍生的蛋白质；
[0022]所述ATP硫酸化酶MET14的编码基因为c1)或c2)所示的DNA分子：
[0023]c1)序列表中序列8所示的DNA分子；
[0024]c2)与c1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述ATP硫酸化酶MET14的DNA分子。
[0025]所述脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1为D1)或D2)所示的蛋白质：
[0026]D1)由序列表中序列15所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0027]D2)由序列表中序列15所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1活性的由D1)衍生的蛋白质；
[0028]所述脂肪酸合成途径蛋白ACC1的编码基因为d1)或d2)所示的DNA分子：
[0029]d1)序列表中序列14所示的DNA分子；
[0030]d2)与d1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的DNA分子。
[0031]更进一步的，所述提高圆红冬孢酵母中粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2的含量和/或活性的方法可为将提高麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
[0032]所述提高圆红冬孢酵母中酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶MET14的含量和/或活性的方法可为将提高ATP硫酸化酶基因MET14表达量的质粒导入圆红冬孢酵母中。
[0033]所述降低圆红冬孢酵母中脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的含量和/或活性的方法为将敲除脂肪酸合成途径关键基因ACC1或其启动子的质粒导入圆红冬孢酵母中。
[0034]在本专利技术的一个具体实施例中，所述提高麦角硫因合成酶基因Ncegt1和Ncegt2表达量的质粒为2*Ncegt1
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P2A
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Ncegt2质粒，所述2*Ncegt1
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P2A
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Ncegt2质粒将Ncegt1
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P2A
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Ncegt2质粒中Xba I和Spe I酶切位点之间的片段替换为Ppgk2
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Ncegt1
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P2A
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Ncegt2
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Tnos2片段(Ppgk2
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Ncegt1
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P2A
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Ncegt2
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Tnos2片段的核苷酸序列如序列7所示)后得到的质粒。所述Ncegt1
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P2A
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Ncegt2质粒为将pkocar2载体中Nco I和EcoR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产麦角硫因重组菌的构建方法，包括如下步骤：提高圆红冬孢酵母中粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成酶Ncegt1和Ncegt2的含量和/或活性；且提高所述圆红冬孢酵母中酿酒酵母来源的ATP硫酸化酶MET14的含量和/或活性，且降低所述圆红冬孢酵母中脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1的含量和/或活性。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述麦角硫因合成酶Ncegt1为A1)或A2)所示的蛋白质：A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt1活性的由A1)衍生的蛋白质；或，所述麦角硫因合成酶Ncegt1的编码基因为a1)或a2)所示的DNA分子：a1)序列表中序列1所示的DNA分子；a2)与a1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt1的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于：所述麦角硫因合成酶Ncegt2为B1)或B2)所示的蛋白质：B1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有麦角硫因合成酶Ncegt2活性的由B1)衍生的蛋白质；或，所述麦角硫因合成酶Ncegt2的编码基因为b1)或b2)所示的DNA分子：b1)序列表中序列3所示的DNA分子；b2)与b1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述麦角硫因合成酶Ncegt2的DNA分子。4.根据权利要求1
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3任一所述的构建方法，其特征在于：所述ATP硫酸化酶MET14为C1)或C2)所示的蛋白质：C1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；C2)由序列表中序列9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有ATP硫酸化酶MET14活性的由C1)衍生的蛋白质；或，所述ATP硫酸化酶MET14的编码基因为c1)或c2)所示的DNA分子：c1)序列表中序列8所示的DNA分子；c2)与c1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述ATP硫酸化酶MET14的DNA分子。5.根据权利要求1
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4任一所述的构建方法，其特征在于：所述脂肪酸合成途径关键蛋白ACC1为D1)或D2)所示的蛋白质：D1)由序列表中序列15所示的氨基酸序列组成的蛋白质；D2)由序列表中序列15所示的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢慧珍，姜浩，刘锋，庄满生，
申请(专利权)人：合曜生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：