Cas制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复

【技术实现步骤摘要】
Cas突变蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复
(CRISPR)


。
具体而言，本专利技术涉及一种活性提高的突变的
Cas
蛋白及其应用
。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas
技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过
RNA
引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割
DNA
产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑
。
[0003]CRISPR/Cas9
系统是最常用的
II
型
CRISPR
系统，它识别3’‑
NGG
的
PAM
基序，对靶标序列进行平末端切割
。CRISPR/Cas Type V
系统是一类新发现的
CRISPR
系统，它具有5’‑
TTN
的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如
Cpf1,C2c1,CasX,CasY。
然而目前存在的不同的
CRISPR/Cas
各有不同的优点和缺陷
。
例如
Cas9,C2c1
和
CasX
均需要两条
RNA
进行指导
RNA
，而
Cpf1
只需要一条指导
RNA
而且可以用来进行多重基因编辑
。CasX
具有
980
个氨基酸的大小，而常见的
Cas9
，
C2c1
，
CasY
和
Cpf1
通常大小在
1300
个氨基酸左右
。
此外，
Cas9
，
Cpf1
，
CasX
，
CasY
的
PAM
序列都比较复杂多样，而
C2c1
识别严谨的5’‑
TTN
，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应
。
[0004]中国专利技术专利
CN111757889B
中公开了一种
Cas
蛋白
Cas12f.4
，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，但是，其编辑活性并不高，为了提高该蛋白的编辑效率，本申请对该蛋白进行了优化，提高了其在真核细胞中的编辑效率
。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对
Cas12f.4(
本申请中将其称之为，
Cas12i3
或
Cas12i.3)
蛋白的定点突变，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围
。
[0006]Cas
效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一种活性改善或活性提高的
Cas
突变蛋白，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第
16
位
、
第
168
位
、
第
179
位
、
第
233
位
、
第
235
位
、
第
260
位
、
第
267
位
、
第
292
位
、
第
325
位
、
第
326
位
、
第
331
位
、
第
332
位
、
第
362
位
、
第
440
位
、
第
467
位
、
第
473
位
、
第
505
位
、
第
509
位
、
第
601
位
、
第
790
位
、
第
849
位
、
第
851
位
、
第
944
位
、
第
599
位或第
940
位
。
[0008]在一个实施方式中，所述第
16
位氨基酸或第
362
位氨基酸或第
509
位氨基酸突变为非
P
的氨基酸，例如，
A
，
V
，
G
，
L
，
Q
，
F
，
W
，
Y
，
D
，
S
，
E
，
K
，
M
，
T
，
C
，
N
，
H
，
R
，
I
；优选，所述第
16
位氨基酸或第
362
位氨基酸或第
509
位氨基酸突变为
R。
[0009]在一个实施方式中，所述第
168
位氨基酸或第
260
位氨基酸或第
325
位氨基酸或第
467
位氨基酸突变为非
N
的氨基酸，例如，
A
，
V
，
G
，
L
，
Q
，
F
，
W
，
Y
，
D
，
S
，
E
，
K
，
M
，
T
，
C
，
P
，
H
，
R
，
I
；优选，所述第
168
位氨基酸或第
260
位氨基酸或第
325
位氨基酸或第
467
位氨基酸突变为
R
；优选，所述第
168
位氨基酸突变为
W。
[0010]在一个实施方式中，所述第
179
位氨基酸或第
32本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Cas
突变蛋白，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第
16
位
、
第
168
位
、
第
179
位
、
第
233
位
、
第
235
位
、
第
260
位
、
第
267
位
、
第
292
位
、
第
325
位
、
第
326
位
、
第
331
位
、
第
332
位
、
第
362
位
、
第
440
位
、
第
467
位
、
第
473
位
、
第
505
位
、
第
509
位
、
第
601
位
、
第
790
位
、
第
849
位
、
第
851
位
、
第
944
位
、
第
599
位或第
940
位
。2.
根据权利要求1所述的
Cas
突变蛋白，其特征在于，所述亲本
Cas
蛋白为
Cas12i
蛋白；优选的，所述亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID No.1
相比具有至少
80
％的序列同一性
。3.
一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1‑2任一所述的
Cas
突变蛋白以及其他的修饰部分
。4.
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1‑2任一所述
Cas
突变蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求3所述融合蛋白的多核苷酸序列
。5.
一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件
。6.
一种
CRISPR
‑
Cas
系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1‑2任一所述的
Cas
突变蛋白以及至少一种
gRNA
；所述
gRNA
能够结合权利要求1‑2任一所述的
Cas
突变蛋白
。7.
一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：
(i)
蛋白组分，其选自：权利要求1‑2任一所述的
Cas
突变蛋白或权利要求3所述的融合蛋白；
(ii)
核酸组分，其为
gRNA
，所述
gRNA
能够结合权利要求1‑2任一所述的
Cas
突变蛋白；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物
。8.
一种活化的
CRISPR
复合物，所述活化的
CRISPR
复合物包含：
(i)
蛋白组分，其选自：权利要求1‑2任一所述的
Cas
突变蛋白或权利要求3所述的融合蛋白；
(ii)
核酸组分，其为
g...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：