Cas12a突变体蛋白、含有Cas12a突变体蛋白的基因编辑系统及应用技术方案

本发明专利技术涉及基因编辑技术领域，具体地涉及一种Mb4Cas12a突变体蛋白以及采用该突变体蛋白的CRISPR/Cas12a基因编辑系统以及其应用。本发明专利技术的Mb4Cas12a突变体蛋白与crRNA形成的复合体能够精确地定位靶向DNA序列并产生切割，使所述靶序列发生双链断裂损伤，具有高的特异性，能够降低细胞中或体外进行基因编辑的脱靶率，并且能够区分出靶位点的单碱基差异，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
Cas12a突变体蛋白、含有Cas12a突变体蛋白的基因编辑系统及应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，具体地涉及一种Cas12a突变体蛋白、包含该突变体蛋白的CRISPR/Cas12a基因编辑系统以及其相关应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统，其中CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统被开发为基因编辑工具。这两种系统又可以被进一步分成若干亚类。CRISPR/Cas12a系统属于CRISPR/Cas12的一个亚类，依靠crRNA(CRISPR
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derived RNA)与Cas12共同形成复合物发挥功能，不含有tracrRNA(trans
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activating RNA)。当DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接(Non
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homologous end
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joining，NHEJ)和同源重组(homologous recomb本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas12a突变体蛋白，所述Cas12a突变体蛋白包含对应于野生型Mb4Cas12a蛋白的G257、N276、K291和F370中的一个或多个氨基酸残基处的突变；优选地，所述突变为选自G257A、N276A、K291A和F370A中的一个或者多个点突变，更优选为G257A、N276A、K291A或F370A；优选地，所述Cas12a突变体蛋白与所述野生型Mb4Cas12a蛋白具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。2.一种缀合物，所述缀合物包含：a)权利要求1所述的Cas12a突变体蛋白；b)修饰部分；例如，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测标记或其组合；例如，所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种；以及c)任选的用于连接所述Cas12a突变体蛋白与所述修饰部分的接头，例如长度为1
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50个氨基酸的接头。3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：a)权利要求1所述的Cas12a突变体蛋白；b)另外的蛋白和多肽；例如，所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种；以及c)任选的用于连接所述Cas12a突变体蛋白与所述修饰部分的接头，例如长度为1
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50个氨基酸的接头。4.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码以下的核酸序列：a)权利要求1所述的Cas12a突变体蛋白；b)权利要求2所述的缀合物；或者c)权利要求3所述的融合蛋白。5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子还包含编码能够与所述Cas12a突变体蛋白联用的单链向导RNA的核酸序列，所述单链向导RNA包括支架序列(例如SEQ ID NO:2所示的支架序列)和CRISPR间隔序列，优选地所述CRISPR间隔序列为长度为18
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28个核苷酸(优选24个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。6.一种载体，所述载体包含编码以下的核酸序列：a)权利要求1所述的Cas12a突变体蛋白；b)权利要求2所述的缀合物；或者c)权利要求3所述的融合蛋白；例如，所述载体为质粒载体例如pUC19载体、附着体载体、pAAV2_ITR载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。7.根据权利要求6所述的载体，其中，所述载体进一步包含编码能够与所述Cas12a突变体蛋白联用的单链向导RNA的核酸序列，所述单链向导RNA包含支架序列(例如SEQ ID NO:2
所示的支架序列)和CRISPR间隔序列，优选地所述CRISPR间隔序列为长度为18
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28个核苷酸(优选24个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。8.一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其包含：1)蛋白组分，其包含：a)权利要求1所述的Cas12a突变体蛋白；b)权利要求2所述的缀合物；或者c)权利要求3所述的融合蛋白；以及2)单链向导RNA，所述单链向导RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永明，魏京京，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：