新型制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复

【技术实现步骤摘要】
新型Cas酶和系统以及应用
[0001]本专利技术为申请日
2022
年
10
月
28
日，名称为“新型
Cas
酶和系统以及应用”的中国专利申请
CN 2022113348258
的分案申请
。


[0002]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复
(CRISPR)


。
具体而言，本专利技术涉及一种新型的
CRISPR
酶
(
或者，称之为
CRISPR
蛋白
、Cas
效应蛋白
、Cas
酶或
Cas
蛋白
)
，包含此类蛋白的融合蛋白，以及编码它们的核酸分子
。
本专利技术还涉及用于核酸编辑
(
例如，基因或基因组编辑
)
的复合物和组合物，其包含本专利技术的
Cas
蛋白或融合蛋白，或编码它们的核酸分子
。

技术介绍

[0003]CRISPR/Cas
技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过
RNA
引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割
DNA
产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑
。
[0004]CRISPR/Cas9
系统是最常用的
II
型
CRISPR
系统，它识别3’‑
NGG
的
PAM
基序，对靶标序列进行平末端切割
。CRISPR/Cas Type V
系统是一类新发现的
CRISPR
系统，它具有5’‑
TTN
的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如
Cpf1,C2c1,CasX,CasY。
然而目前存在的不同的
CRISPR/Cas
各有不同的优点和缺陷
。
例如
Cas9,C2c1
和
CasX
均需要两条
RNA
进行指导
RNA
，而
Cpf1
只需要一条指导
RNA
而且可以用来进行多重基因编辑
。CasX
具有
980
个氨基酸的大小，而常见的
Cas9
，
C2c1
，
CasY
和
Cpf1
通常大小在
1300
个氨基酸左右
。
此外，
Cas9
，
Cpf1
，
CasX
，
CasY
的
PAM
序列都比较复杂多样，而
C2c1
识别严谨的5’‑
TTN
，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应
。
[0005]总之，鉴于目前可获得的
CRISPR/Cas
系统都受限于一些缺陷，开发一种更稳健的
、
具有多方面良好性能的新型
CRISPR/Cas
系统对生物技术的发展具有重要意义
。

技术实现思路

[0006]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一种新型核酸内切酶
(Cas
酶
)。
基于这一发现，本专利技术人开发了新的
CRISPR/Cas
系统以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法
。
[0007]Cas
效应蛋白
[0008]一方面，本专利技术提供了一种
Cas
蛋白，所述
Cas
蛋白是
CRISPR/Cas
系统中的效应蛋白，在本专利技术，将其称之为
Cas
‑
sf0009(SEQ ID No.1
所示
)、Cas
‑
sf1782(SEQ ID No.4
所示
)、Cas
‑
sf2431(SEQ ID No.7
所示
)
；进化树分析显示，上述
Cas
蛋白属于
Cas12j
家族的
Cas
蛋白
。
[0009]在一个实施方式中，所述
Cas
蛋白氨基酸序列与
SEQ ID No.1
相比具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
氨基酸残基是生物活性所需的
。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换
。
氨基酸置换可以在上述
Cas
蛋白的非保守区域中进行
。
一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的
。
然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变
。
[0017]表1[0018]最初的残基代表性的取代优选的取代
Ala(A)Val
；
Leu
；
IleValArg(R)Lys
；
Gln
；
AsnLysAsn(N)Gln
；
His
；
Lys
；
ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro
；
AlaAlaHis(H)Asn
；
Gln
；
Lys
；
ArgArgIle(I)Leu
；
Val
；
Met
；
Ala
；
PheLeuLeu(L)Ile
；
Val
；
Met
；
Ala
；
PheIleLys(K)Arg
；
Gln
；
AsnArgMet(M)Leu
；
Phe
；
IleLeuPhe(F)Leu本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Cas
蛋白，其特征在于，所述
Cas
蛋白为以下
I
‑
III
任一所述的
Cas
蛋白：
I、Cas
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID No.4
或
SEQ ID No.7
相比，具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
、
至少
99.1
％
、
至少
99.2
％
、
至少
99.3
％
、
至少
99.4
％
、
至少
99.5
％
、
至少
99.6
％
、
至少
99.7
％
、
至少
99.8
％
、
或至少
99.9
％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；
II、
所述
Cas
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID No.4
或
SEQ ID No.7
相比，具有一个或多个氨基酸的置换
、
缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；
III、
所述
Cas
蛋白包含
SEQ ID No.4
或
SEQ ID No.7
所示的氨基酸序列
。2.
一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的
Cas
蛋白和其他的修饰部分
。3.
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述
Cas
蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列
。4.
一种
gRNA
，其特征在于，所述
gRNA
包括能够结合权利要求1所述的
Cas
蛋白的同向重复序列和能够靶向靶序列的引导序列
。5.
一种同向重复序列，其特征在于，所述同向重复序列包含
SEQ ID No.10
‑
12
任一所示的序列
。6.
一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件
。7.
一种
CRISPR
‑
Cas
系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的
Cas
蛋白以及至少一种权利要求4所述的
gRNA。8.
一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：
a)
第一调控元件，该第一调控元件可操作地与权利要求4所述的
gRNA
连接，
b)
第二调控元件，该第二调控元件可操作地与权利要求1所述的
Cas
蛋白连接；其中组分
(a)
和
(b)
位于该系统的相同或不同载体上
。9.
一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：
(i)
蛋白组分，其选自：权利要求1所述的
Cas
蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；
(ii)
核酸组分，其选自：权利要求4所述的
gRNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的核酸，或权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
核酸；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物
。10.
一种活化的
CRISPR
复合物，所述活化的
CRISPR
复合物包含：
(i)
蛋白组分，其选自：权利要求1所述的
Cas
蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；
(ii)
核酸组分，其选自：权利要求4所述的
gRNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的核酸，或权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
核酸；
(iii)
结合在权利要求4所述的
gRNA
上的靶序列
。11.
一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，孙洁，赵庆芝，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：