一种获得非转基因香味增加藜麦的方法技术

本发明专利技术提供了一种获得具有香味增加性状的藜属植物的方法，具体地，本发明专利技术提供了减少表达CqBADH2基因的用途。本发明专利技术首次发现，通过抑制或减少藜属植物CqBADH2基因的表达，可以显著提高藜属植物的香味。另外，本发明专利技术首次实现了藜麦中利用基因编辑技术同时精确编辑多个基因或等位基因，并完成了的稳定递送，为藜麦的靶向分子育种提供了良好的平台。麦的靶向分子育种提供了良好的平台。麦的靶向分子育种提供了良好的平台。

【技术实现步骤摘要】
一种获得非转基因香味增加藜麦的方法


[0001]本专利技术属于生物技术育种领域，涉及一种获得香味增加藜麦的方法，特别涉及一种利用基因组编辑技术定点突变主栽藜麦甜菜碱醛脱氢酶的CqBADH2.1、CqBADH2.2基因，获得藜麦增香的育种材料的方法。

技术介绍

[0002]藜麦（Chenopodium quinoa）是一种拥有7000年历史的古老作物，原产于安第斯山脉，兴盛于印加文明，是一种耐寒耐旱的、能够适应于不能纬度和海拔的植物。其藜麦种子中的蛋白质含量高达14%，其中48%的氨基酸为人体必需氨基酸。联合国粮农组织（FAO）认为藜麦是唯一一种能够满足人体基本营养需求的单体植物。被誉为人类完美的“全营养品”、人类移民太空的“理想粮食”。
[0003]藜麦是异源四倍体，由祖先二倍体A基因组（C. pallidicaule）和B基因组（C. suecicum）杂交而成，其基因组的复杂性导致目前还没有成功建立起高效的离体再生体系和遗传转化体系，使得分子育种进程受阻。Fayza Ruzayq AI Gethami等人建立了以藜麦子叶节为起始外植体的再生体系(Fayza Ruzayq AI Gethami and Hameda EI Sayed Ahmed EI Sayed. In Vitro:Influence of Various Concentrations of Plant Growth Regulators (BAP&NAA)and Sucrose on Regeneration of Chenopodium quinoa Willd Plant. Journal of Advance in Biology& Biotechnology (2020))。王燕芳等人建立了藜麦发根农杆菌和原位转化藜麦叶片的方法(Yanfang Wang et al., The Establishment of Two Efficient Transformation Systems in Quinoa. Research Square. 2021)，但没有获得稳定的再生植株。
[0004]本文是首次在藜属植物藜麦中利用CRISPR/Cas9技术同时精确编辑多个基因或等位基因，完成了的稳定递送，为藜麦的靶向分子育种提供了良好的平台。在本专利技术的遗传转化体系的基础上，获得了敲除CqBADH2.1、CqBADH2.2的突变体植株，该突变体植株具有香味增加的表型。而在本研究出现之前，仅在二倍体玉米、大豆、水稻中实现该基因的编辑。本研究的出现，填补了在藜麦作物研究上的空白。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种获得具有香味增加的藜属植物的方法，特别是提供一种或的具有香味增加的藜麦的方法，并解决了获得稳定的再生藜麦的技术问题。
[0006]本专利技术的第一目的是提供一种获得具有香味增加的藜属植物的方法，其中所述方法包括靶向基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的藜属植物相比，所述靶向基因组修饰赋予藜属植物CqBADH2基因的减少表达。
[0007]优选的，所述藜属植物为藜麦。
[0008]优选的，所述CqBADH2基因包括具有SEQ No.1中所示的序列或其功能变体的CqBADH2.1、具有如SEQ No.4中所示的序列或其功能变体的CqBADH2.2。
[0009]优选的，所述功能变体与其相应的CqBADH2核苷酸序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%的序列同一性。
[0010]进一步优选的，所述CqBADH2.1和CqBADH2.2同时减少表达。
[0011]在一个实施方式中，所述靶向基因组修饰为插入、缺失或取代。
[0012]在一个实施方式中，所述基因组修饰的方法包括基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因/蛋白的抑制剂或其任意组合。
[0013]在一个实施方式中，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas、TALEN、ZFN、大范围核酸酶或其任意组合。
[0014]在一个实施方式中，所述靶向基因组修饰的靶位点包含5
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(SEQ No.9)的核苷酸序列或其互补序列。
[0015]优选的，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas技术；其中所述CRISPR/Cas技术中Cas效应蛋白选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3 (或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966及其任何组合。
[0016]在一个实施方式中，所述方法包括如下步骤：在藜属植物中引入Cas效应蛋白以及靶向CqBADH2基因靶位点的sgRNA；筛选具有靶向基因组修饰的植物。
[0017]优选的，所述基因组修饰是由在藜属植物中引入包含以下的构建体产生：（a）Cas效应蛋白DNA，和选自SEQ No.16或SEQ No.17或二者组合的sgRNA序列；或（b）包含Cas效应蛋白和选自SEQ No.16或SEQ No.17或二者组合的sgRNA序列的核糖核蛋白（RNP）复合物。
[0018]进一步优选的，所述构建体使用以下方法引入植物细胞内：农杆菌介导递送、基因枪递送、聚乙二醇介导递送、病毒介导递送、纳米颗粒借调递送或通过嫁接的DNA递送。
[0019]进一步优选的，所述方法包括使具有靶向基因组修饰的植物再生的步骤。
[0020]在一个实施方式中，所述再生步骤包括将植物材料接种于不定芽诱导培养基。
[0021]优选的，所述不定芽诱导培养基包括基础盐培养基和激素成分。
[0022]进一步优选的，所述激素成分含有2
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3 mg/L反式玉米素核苷（tZT）、0.5mg/L 三碘苯甲酸（TIBA）、0.5
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1mg/L 萘乙酸（NAA）。
[0023]进一步优选的，所述激素成分含有2 mg/L 反式玉米素核苷（tZT）、0.5mg/L 三碘苯甲酸（TIBA）、0.5mg/L 萘乙酸（NAA）。
[0024]本专利技术的第二目的是提供一种sgRNA的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得具有香味增加的藜属植物的方法，其中所述方法包括靶向基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的藜属植物相比，所述靶向基因组修饰赋予藜属植物CqBADH2基因的减少表达；其中所述CqBADH2基因包括具有SEQ No.1中所示的序列或其功能变体的CqBADH2.1、具有如SEQ No.4中所示的序列或其功能变体的CqBADH2.2；其中所述功能变体与其相应的CqBADH2核苷酸序列具有至少90%的序列同一性；所述CqBADH2.1和CqBADH2.2同时减少表达。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向基因组修饰为插入、缺失或取代；所述基因组修饰的方法包括基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、基因编辑技术、导入基因/蛋白的抑制剂或其任意组合。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas、TALEN、ZFN、大范围核酸酶或其任意组合。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述靶向基因组修饰的靶位点包含如SEQ No.9所示的5
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的核苷酸序列或其互补序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas技术；其中所述CRISPR/Cas技术中Cas效应蛋白选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Cse3、Cse4、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张康，冉毅东，高崑，张立肖，徐虎，
申请(专利权)人：北京齐禾生科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：