小麦DNA去甲基化酶基因TaROS1基因编辑载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了小麦DNA去甲基化酶基因TaROS1基因编辑载体及其应用，属于作物分子生物学领域，本发明专利技术设计引物从扬麦18幼穗cDNA中克隆TaROS1的编码区序列，TaROS1基因编码区序列在A、B、D同源染色体中的序列分别如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
小麦DNA去甲基化酶基因TaROS1基因编辑载体及其应用


[0001]本专利技术属于作物分子生物学领域，涉及小麦TaROS1基因的克隆、基因编辑CRISPR/Cas9
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TaROS1载体构建及其TaROS1基因在调控小麦籽粒糊粉层细胞厚度中的应用。

技术介绍

[0002]小麦糊粉层亦称外胚乳，是小麦籽粒种皮最内层细胞，位于小麦籽粒种皮和胚乳之间。小麦糊粉层为单细胞层结构，只占麦粒总质量的7％～9％，但其营养成分含量却占小麦总营养的60％～70％，高营养价值的生理活性成分(膳食纤维、矿物质、有益脂类、维生素、酚酸类和木酚素等)均集中在糊粉层中。因此，小麦糊粉层极富高营养价值的生理活性成分，被称为小麦中的软黄金。小麦糊粉层丰富的营养构成使其成为极具潜力的新型食品及原料，应用前景十分广泛。作为主食，我国年消耗小麦约1亿吨左右用于生产面粉，大约年产麸皮近3千万吨，如果把麸皮中的糊粉层提取分离出30％用于食用，每年可增加粮食近千万吨。同时糊粉层制品添加到面粉中，以改善面粉营养结构，可提高粮食的利用率和营养品质。目前，小麦糊粉层分离技术已经成熟，并产业化。因此，创制糊粉层增厚的小麦新种质对提高小麦营养和和经济价值具有突破性意义。培育糊粉层增厚的小麦品种可进一步提升小麦糊粉层市场前景和产品盈利空间，实现小麦生产的提质增效。
[0003]禾谷类作物糊粉层是由胚乳表层细胞停止分裂后转化成而来，约占胚乳部分的5％～10％。除大麦含有3细胞层及水稻小部分区域为可变糊粉层外，禾谷类作物糊粉层主要为单细胞层结构。目前为止，小麦中ROS1基因的研究很少，尤其是ROS1在小麦中的功能研究和生产应用。因此，有必要在小麦中敲除ROS1，深入研究ROS1在小麦籽粒糊粉层发育中的作用，创制糊粉层细胞增厚的小麦新材料，为小麦高营养品质育种提供基因资源。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供小麦TaROS1基因及其应用。
[0005]在六倍体小麦扬麦18幼穗的cDNA中扩增TaROS1基因，得到在A、B、D同源染色体上的基因序列，分别如SEQ ID NO.1
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3所示，该基因命名为TaROS1，该基因定位于第5染色体同源群上。
[0006]具体地，本专利技术所述的小麦TaROS1基因位于小麦第5同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦5D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。分别命名为TaROS1
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5A、TaROS1
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5B和TaROS1
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5D。其对应的中国春基因组序列(RefSeq v1.1)全长分别为12423、13427和12210个碱基，3个基因均由18个外显子和17个内含子组成。根据这些基因信息，我们利用同源克隆的方法，在扬麦18幼穗的cDNA中克隆获得TaROS1
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5A、TaROS1
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5B和TaROS1
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5D基因。3个基因分别含5928、5949和5946个碱基的开放阅读框，分别编码1975、1982和1981个氨基酸残基的多肽链。这三个部分同源基因之间，除了第一个外显子外，其他的外显子相似性非常高，这一特征为利用基因编辑技术同步沉默上述三个位点的TaROS1基因提供了理论依据。在实际
应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平ROS1基因的沉默。
[0007]本专利技术提供了小麦TaROS1基因在植物种质资源改良中的应用。
[0008]所述植物包括但不限于小麦。
[0009]本专利技术提供了用于克隆小麦TaROS1基因的引物组合ROS1
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F和ROS1
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R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8
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9所示。
[0010]相应地，本专利技术提供了小麦TaROS1基因的克隆方法，利用SEQ ID NO.8
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9所示的特异性引物组合，以小麦穗子cDNA为模板，PCR扩增得到小麦TaROS1基因。
[0011]本专利技术提供了一种提高小麦种子中糊粉层细胞数量的方法，包括如下步骤：对TaROS1基因进行基因编辑
[0012]以上任一所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。
[0013]本专利技术提供了构建TaROS1 CRISPR/Cas9载体的靶位点及其应用。
[0014]本专利技术提供了小麦TaROS1 CRISPR/Cas9载体的靶位点序列为sgRNA1和sgRNA2，靶位点核苷酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
[0015]含有上述靶位点序列的CRISPR/Cas9载体属于本专利技术的保护范围。
[0016]所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA1的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
[0017]所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA2的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在受体小麦中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。
[0018]本专利技术还保护特异sgRNA。所述特异sgRNA为sgRNA1或sgRNA2。
[0019]本专利技术还保护特异重组质粒。所述特异重组质粒为pLGYE
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sgROS1。
[0020]sgRNA1的靶标序列如下：GCCAGAGCAAAGCAAATTGG(SEQ ID NO.4)。
[0021]sgRNA2的靶标序列如下：GAAGTTCCTGCTGACAGATC(SEQ ID NO.5)。
[0022]pLGYE
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sgROS1含有Cas9蛋白的编码基因和所述sgRNA1和sgRNA2的编码基因。
[0023]本专利技术提供了TaROS1基因CRISPR/Cas9转基因植株，其具有小麦籽粒糊粉层显著增厚表型。
[0024]本专利技术还保护所述特异sgRNA或所述特异重组质粒在小麦育种中的应用。
[0025]有益效果：
[0026]本专利技术提供了小麦TaROS1基因的克隆方法以及小麦TaROS1基因在调控籽粒糊粉层厚度的生物学功能，本专利技术实验发现小麦TaROS1基因被定点敲除后，小麦籽粒糊粉层细胞层数均明显增加。本专利技术的小麦TaROS1基因对于小麦遗传育种和种质资源改良具有重要的应用价值。
附图说明
[0027]图1 TaROS1基因第3外显子双靶标sgRNA1和sgRNA2位置。
[0028]图2重组基因编辑载体质粒pLGYE
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sgROS1 PCR鉴定图：c1
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c6为重组质粒pLGYE
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sgROS1；p为空载体pLGYE
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.小麦DNA去甲基化酶基因TaROS1在调控小麦籽粒糊粉层细胞厚度中的应用，其特征在于抑制TaROS1基因表达，能够提高小麦籽粒糊粉层细胞厚度；所述小麦TaROS1基因位于小麦第5同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦5D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于通过TaROS1基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统实现抑制TaROS1基因表达。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的TaROS1基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统针对双靶标sgRNA，其序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的TaROS1基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统为含有权利要求3中所述的双靶标sgRNA的表达框的重组质粒载体pLGYE
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sgROS1。5.一种针对权利要求1中所述的小麦TaROS1基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于，以pLGYE
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3为出发载体，BsaI酶切位点插入针对TaROS1基因双靶标sgRNA的表达框，所述的TaROS1基因双靶标sgRNA序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。6.根据权利要求5所述的小麦TaROS1基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于所述的TaROS1基因双靶标sgRNA的表达框序列如SEQ ID NO.10所示。7.权利要求5所述CRISPR/Cas9载体的构建方法，提特征在于包括如下步骤：S1：在靶向TaROS1基因第3个外显子保守序列处设计靶标sgRNA1和sgRNA2；S2：...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋正宁，高德荣，张勇，别同德，刘大同，吴旭江，张晓，江伟，
申请(专利权)人：江苏里下河地区农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：