同源重组酶在莱茵衣藻基因组编辑中的应用制造技术

本发明专利技术公开了同源重组酶在莱茵衣藻基因组编辑中的应用。所述同源重组酶包括同源重组酶ScRad51、同源重组酶ScRad52、同源重组酶ScRad54或同源重组酶EcRecA中任意一种。本发明专利技术挖掘能够在莱茵衣藻中高效表达的同源重组酶，进一步对编码基因进行序列优化，实现在莱茵衣藻中高效稳定表达，同时构建表达同源重组酶的莱茵衣藻工程株，实现提高莱茵衣藻中同源重组频率，继而提高基因编辑效率。继而提高基因编辑效率。继而提高基因编辑效率。

【技术实现步骤摘要】
同源重组酶在莱茵衣藻基因组编辑中的应用


[0001]本专利技术属于合成生物学
，涉及同源重组酶在莱茵衣藻基因组编辑中的应用。

技术介绍

[0002]目前代谢工程、基因编辑和合成生物学的创新工具正在迅速发展，莱茵衣藻的核基因组转化技术也比较成熟，但由于其核基因组的同源重组频率极低，外源基因主要是以随机整合的方式插入到核基因组中，还不能达到精确编辑基因组的目的。目前，莱茵衣藻靶向基因失活效率在10
‑
15％之间，其中仅1
‑
2％的转化子中检测到精确的同源定向修复，极低的精确靶向效率也是藻类在合成生物学领域作为底盘细胞的主要瓶颈。为了充分利用CRISPR/Cas基因编辑系统的功能，提高衣藻的基因编辑效率，需要对DNA断裂修复机制中的同源重组修复途径建立深刻的理解。
[0003]由于重组途径在基因编辑过程中的重要性，HR途径中的关键蛋白常被用于同源重组过程的研究。1996年，Reiss等在烟草中研究发现，表达RecA蛋白的转基因细胞中，在携带内源核标记基因的特定位点上，同源重组至少被刺激10倍。2000年，Reiss科研团队进一步发现RecA蛋白虽能提高烟草体内的同源重组效率，导致姐妹染色单体交换频率增高，但并不能显著增加靶基因替换的数量，RecA可以促进姐妹染色单体交换和双链断裂修复，但不能提高基因打靶效率，表明RecA的刺激活性与活跃的DNA合成有关。2004年，Li证明在水稻胚性细胞中瞬时表达recQ基因可以使同源重组效率提高4倍多，2005年，Shaked报道发现酵母rad54基因的表达使拟南芥的基因靶向效率提高了一到两个数量级。2020年，Abdellah等研究发现在烟草转基因株系中以不同的组合表达了几种细菌和人的重组酶，大多数重组酶显著增加了花粉中的同源重组，在减数分裂过程中发生的DSB将促进HR。关于重组酶在哺乳动物的同源重组作用研究中，早在1998年，St
é
phane等研究发现过表达RAD51蛋白能刺激哺乳动物细胞同源重组并增强其对电离辐射的抗性；在2021年，Jonathan等人在Cell杂志上发表的文章发现小鼠受精卵联合注射RAD51和Cas9可增强同源修复并促进杂合等位基因向纯合等位基因的转化。同年，Sijie Liu等人也在Cell杂志发表文章表明，RNA聚合酶III是同源重组修复DNA双链断裂所必须的酶。
[0004]综上所述，目前对莱茵衣藻基因定向编辑的关注点都聚集在抑制NHEJ通路上，未发现HR途径的相关报道，因此，探索HR途径的同源重组酶在衣藻中的功能显得尤为重要，为莱茵衣藻细胞核DNA的定向敲除、替换技术提供研究基础。

技术实现思路

[0005]针对鲜有能技术的不足，本专利技术提供同源重组酶在莱茵衣藻基因组编辑中的应用，挖掘能够在莱茵衣藻中高效表达并提高同源重组频率的同源重组酶，继而提高基因编辑效率。
[0006]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供同源重组酶在莱茵衣藻基因组编辑中的应用，所述同源重组酶包括同源重组酶ScRad51(酿酒酵母Rad51)、同源重组酶ScRad52(酿酒酵母Rad52)、同源重组酶ScRad54(酿酒酵母Rad54)或同源重组酶EcRecA(大肠杆菌RecA)中任意一种组合。
[0008]本专利技术中，挖掘能够在莱茵衣藻中高效表达并提高同源重组频率的同源重组酶，酿酒酵母Rad51在莱茵衣藻HR修复途径中起到链交换的作用；酿酒酵母Rad52介导入侵的链可以在塌陷的DNA复制叉处退火；单独的酿酒酵母Rad54蛋白可以在体外介导沿DNA的核小体运动，在同源重组期间促进链侵袭；大肠杆菌RecA在HR途径中主要有两个作用：依赖ATP的互补单链DNA之间的链退火，以及依赖ATP的单链DNA和双链DNA内同源序列之间DNA链入侵；继而提高基因编辑效率。
[0009]同源重组酶ScRad51、同源重组酶ScRad52、同源重组酶ScRad54或同源重组酶EcRecA的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.4所示。
[0010]SEQ ID NO.1：
[0011]MSQVQEQHISESQLQYGNGSLMSTVPADLSQSVVDGNGNGSSEDIEATNGSGDGGGLQEQAEAQGEMEDEAYDEAALGSFVPIEKLQVNGITMADVKKLRESGLHTAEAVAYAPRKDLLEIKGISEAKADKLLNEAARLVPMGFVTAADFHMRRSELICLTTGSKNLDTLLGGGVETGSITELFGEFRTGKSQLCHTLAVTCQIPLDIGGGEGKCLYIDTEGTFRPVRLVSIAQRFGLDPDDALNNVAYARAYNADHQLRLLDAAAQMMSESRFSLIVVDSVMALYRTDFSGRGELSARQMHLAKFMRALQRLADQFGVAVVVTNQVVAQVDGGMAFNPDPKKPIGGNIMAHSSTTRLGFKKGKGCQRLCKVVDSPCLPEAECVFAIYEDGVGDPREEDE。
[0012]SEQ ID NO.2：
[0013]MNEIMDMDEKKPVFGNHSEDIQTKLDKKLGPEYISKRVGFGTSRIAYIEGWRVINLANQIFGYNGWSTEVKSVVIDFLDERQGKFSIGCTAIVRVTLTSGTYREDIGYGTVENERRKPAAFERAKKSAVTDALKRSLRGFGNALGNCLYDKDFLAKIDKVKFDPPDFDENNLFRPTDEISESSRTNTLHENQEQQQYPNKRRQLTKVTNTNPDSTKNLVKIENTVSRGTPMMAAPAEANSKNSSNKDTDLKSLDASKQDQDDLLDDSLMFSDDFQDDDLINMGNTNSNVLTTEKDPVVAKQSPTASSNPEAEQITFVTAKAATSVQNERYIGEESIFDPKYQAQSIRHTVDQTTSKHIPASVLKDKTMTTARDSVYEKFAPKGKQLSMKNNDKELGPHMLEGAGNQVPRETTPIKTNATAFPPAAAPRFAPPSKVVHPNGNGAVPAVPQQRSTRREVGRPKINPLHARKPT。
[0014]SEQ ID NO.3：
[0015]MARRRLPDRPPNGIGAGERPRLVPRPINVQDSVNRLTKPFRVPYKNTHIPPAAGRIATGSDNIVGGRSLRKRSATVCYSGLDINADEAEYNSQDISFSQLTKRRKDALSAQRLAKDPTRLSHIQYTLRRSFTVPIKGYVQRHSLPLTLGMKKKITPEPRPLHDPTDEFAIVLYDPSVDGEMIVHDTSMDNKEEESKKMIKSTQEKDNINKEKNSQEERPTQRIGRHPALMTNGVRNKPLRELLGDSENSAENK本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同源重组酶在莱茵衣藻基因组编辑中的应用，其特征在于，所述同源重组酶包括同源重组酶ScRad51、同源重组酶ScRad52、同源重组酶ScRad54或同源重组酶EcRecA中任意一种。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括同源重组酶ScRad51、同源重组酶ScRad52、同源重组酶ScRad54或同源重组酶EcRecA中任意一种的编码基因。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述同源重组酶ScRad51的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.5所示的序列；优选地，所述同源重组酶ScRad52的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列；优选地，所述同源重组酶ScRad54的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列；优选地，所述同源重组酶EcRecA的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2或3所述的核酸分子；优选地，所述表达载体的形式包括质粒载体或病毒载体。5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求2或3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾彬，李滢伶，胡章立，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：