一种免组培获得茶树转基因根的高效诱导方法技术

本发明专利技术公开一种免组培获得茶树转基因根的高效诱导方法。该方法通过真空渗透法或浸染法，用带荧光报告基因和目的基因的发根农杆菌侵染茶树枝条、叶片基部或叶片划伤切口，两个月即可获得转基因根，建立了快速高效稳定的茶树叶片转基因发根体系。本发明专利技术方法操作简单，免组培方式大大减少了组培的繁琐流程；材料茶树枝条和叶片的获得不受时间限制，不受品种限制；纯蛭石培养基、清水浇灌，具备操作简单、成本低、通量高、周期短等优点。此外，利用荧光报告基因配合手持激发光源，可实现转化子的批量、快速、低成本无损检测。本方法大大提高了茶树获得转基因根的效率，可应用于茶树根系的基因功能研究与精准育种。因功能研究与精准育种。因功能研究与精准育种。

【技术实现步骤摘要】
一种免组培获得茶树转基因根的高效诱导方法


[0001]本专利技术属于作物遗传育种
，尤其涉及一种免组培获得茶树转基因发根的高效诱导方法。

技术介绍

[0002]茶树是重要经济作物，茶树遗传转化体系作为分子精准育种和基因功能研究的辅助工具，是茶树种质资源和创新领域的关键技术。传统茶树遗传转化是在组织培养条件下通过农杆菌共培养转化实现的。植物组织培养需要耗费大量时间、物质和人力，主要原因有以下几点：
[0003]1)实验条件严格：组织培养需要严格控制生长环境，包括pH值、氧气含量、营养盐浓度、激素浓度等，因此需要建立一个严格控制的实验室。
[0004]2)需要有高超的技术：植物组织培养需要技术娴熟的人员进行操作，需要对生物学、化学等学科有深刻的理解和掌握，熟练掌握组织培养技术和操作规范。
[0005]3)大量的试验设备和耗材：进行组织培养需要使用一系列的仪器设备和消耗品，如培养基、培养皿、洗涤溶液、试管、移液管等。
[0006]4)常常存在失败的风险：由于组织培养的复杂性和操作条件的严格要求，常常存在失败的风险，因此需要耗费大量时间和物质资源用于尝试不同的培养方案和操作方法。
[0007]5)研究周期长：植物组织培养是一项长周期的研究，需要在不同的生长阶段进行观察和分析，通常需要几个月甚至几年时间。
[0008]正因为上述不足，在茶树中往往存在以下问题：1、外植体因为消毒不彻底会导致污染率高；2、过度消毒则会因为茶树本身的多酚类物质发生氧化，导致植株褐化死亡；3、共培养阶段的抑菌剂在去除农杆菌的过程中也会对外植体产生负面作用。故而导致现有遗传转化体系培养周期长、操作繁琐、转化效率低，制约了研究的进展和应用的开发。
[0009]本专利技术实现了无需组织培养进行遗传转化的技术方案，将从大田获得的茶树枝条、叶片作为材料，在开放条件下扦插于蛭石培养基中，建立了非组培条件下发根农杆菌介导的茶树遗传转化体系。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种免组培获得转基因发根的高效诱导方法。
[0011]一种用茶树枝条或叶片免组培获得转基因发根的高效诱导方法，包括以下步骤：
[0012]步骤S1、植物材料预处理：
[0013]将茶树枝条或者茶树叶片作为植物材料浸没在同时携带荧光报告基因
‑
目的基因的发根农杆菌菌液中，以保证茶树枝条基部或者茶树叶片的叶柄基部被菌液浸润到；将浸没在发根农杆菌菌液内的植物材料在真空环境下，浸润10
‑
60分钟，得到浸润后的植物材料；
[0014]作为优选，所述茶树枝条为当年生木质化或半木质化的茶树枝条；
[0015]作为优选，所述茶树叶片为当年生萌展40天以上的叶片；
[0016]作为优选，所述茶树叶片在浸润发根农杆菌菌液前，所述茶树叶片进行划伤处理，叶片保持不断裂，且在浸泡时菌液需浸润叶片伤口位置；
[0017]更为优选，所述划伤处理采用米字型划伤方式；
[0018]步骤S2、转基因毛状根的诱导
[0019]将浸润后的植物材料扦插于育苗盘中，确保植物材料的枝条基部、叶柄基部、叶片伤口被育苗盘内基质覆盖，其余部分露出空气中；育苗盘保持基质湿润不积水，移至人工气候室内培养30
‑
60天，生成毛细根；
[0020]作为优选，所述人工气候室内环境具体是光周期为16h光照/8h黑暗，温度保持在22
‑
26℃，湿度保持在70％～90％。
[0021]作为优选，所述育苗盘内基质采用灭菌纯蛭石。培养时育苗盘采用清水浇灌。
[0022]所述同时携带荧光报告基因和目的基因的发根农杆菌中的发根农杆菌采用ATCC15834，具体制备过程如下：
[0023]将携带荧光报告基因
‑
目的基因的ATCC15834农杆菌菌株接种至含有100mg/L硫酸卡那霉素的TY固体培养基中划线培养，28℃恒温培养箱活化培养2天；分别挑取若干单菌落接种至含有100mg/L硫酸卡那霉素的TY液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养12小时；随后将菌液按1:100的比例扩大培养至菌液OD600＝1.0～1.2，5000rpm离心10分钟后收集菌液，弃上清，加入MES缓冲液重悬，调节OD600＝0.8，黑暗28℃静置3
‑
4小时备用。
[0024]本专利技术的另一个目的是提供一种茶树转基因植物，通过所述的方法构建而成。
[0025]本专利技术的有益效果是：
[0026]本专利技术只需要两个月即可获得转基因发根，多种茶树品种的叶片中均可成功转化。本专利技术方法操作简单，免组培方式大大减少了组培的繁琐流程；采用茶树枝条和叶片作为植物材料不受时间限制，不受品种限制；纯蛭石培养基、清水浇灌，具备操作简单、成本低、通量高、周期短等优点。此外，利用GFP标记基因配合手持激发光源，可实现转化子的批量、快速、低成本无损检测。
附图说明
[0027]图1免组培发根农杆菌介导的茶树遗传转化体系的建立(枝条)。
[0028]图21380
‑
ovGFP质粒图谱。
[0029]图3
‘
水仙
’
茶树野生型(WT)、转基因(GFP)枝条不同发育时期。SX：品种为“水仙
’
茶树
’
的茶树(C.sinensis cv.FenghuangShuixian)
[0030]图4野生型和转基因毛状根中使用激光扫描共聚焦显微镜进行GFP验证(横、纵切面)(10倍镜)。
[0031]图5转基因毛状根中使用激光扫描共聚焦显微镜进行GFP亚细胞定位A：40倍、B：160倍。
[0032]图6
‘
水仙
’
茶树转基因毛状根常规PCR验证结果(1380
‑
ovGFP)(目的片段460bp)。
[0033]图7(A)
‘
水仙
’
茶树毛状根RNA提取，(B)
‘
水仙
’
茶树转基因毛状根RT
‑
qPCR验证结果(1380
‑
ovGFP)。
[0034]图8免组培发根农杆菌介导的茶树遗传转化体系的建立(叶片)。
[0035]图9
‘
水仙
’
茶树(SX)野生型(WT)、转基因(GFP)叶片不同发育时期。
[0036]图10
‘
水仙
’
茶树枝条不同部位划伤获得转基因愈伤或毛状根。
[0037]图11福鼎大白茶叶片不同部位划伤获得转基因毛状根(1
‑
3叶片中部，4
‑
6叶片底部)。
[0038]图12不同茶树品种野生型(WT)、转基因(GFP)叶片不同发育时期；(A)：FD即
‘...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免组培获得茶树转基因根的高效诱导方法，包括以下步骤：步骤S1、植物材料预处理：将茶树枝条或者茶树叶片作为植物材料浸没在同时携带荧光报告基因
‑
目的基因的发根农杆菌菌液中，以保证茶树枝条基部或者茶树叶片的叶柄基部被菌液浸润到；将浸没在发根农杆菌菌液内的植物材料在真空环境下，浸润10
‑
60分钟，得到浸润后的植物材料；步骤S2、转基因毛状根的诱导将浸润后的植物材料扦插于育苗盘中，确保植物材料的枝条基部、叶柄基部、叶片伤口被育苗盘内基质覆盖，其余部分露出空气中；育苗盘保持基质湿润不积水，移至人工气候室内培养30
‑
60天，生成毛细根。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤S1中，所述茶树枝条为当年生木质化或半木质化的茶树枝条。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤S1中，所述茶树叶片为当年生萌展40天以上的叶片。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤S1中，所述茶树叶片在浸润发根农杆菌菌液前，所述茶树叶片进行划伤处理，叶片保持不断裂，且在浸泡时菌液需浸润叶片伤口位置。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于步骤S1中，所述划伤处理采用米字型划伤方式。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁慧玲，毛霆锋，刘宁鸽，马海杰，朱梦铃，蒋浩哲，李春芳，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：