一种拟南芥花粉启动子表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种拟南芥花粉启动子表达载体及其构建方法与应用，定义AT3G07070蛋白编码区之前1541bp的序列为该基因启动子，克隆该启动子和蛋白编码区序列共3158bp，其序列如SEQ ID No.1所示，并将其连接进入含有GUS报告基因的表达载体，转化拟南芥植物，筛选并鉴定，最终获得转基因植物。经过分析发现GUS蛋白主要在花粉生长过程的花粉管中表达，说明该启动子可以作为一种分析植物双受精过程的的工具，即可以作为花粉管的标记，另外，该启动子可以启动相关基因在花粉中特异表达，为创制雄性不育材料提供便利。育材料提供便利。育材料提供便利。

【技术实现步骤摘要】
一种拟南芥花粉启动子表达载体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及遗传工程领域，具体涉及一种拟南芥花粉启动子表达载体及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]开花植物要通过双受精过程才能形成受精卵，最终获得种子后代。花粉的功能在双受精过程中尤为关键，将直接影响植物的结实与传代，因此很多育种技术都是围绕雄性不育开展的，比如三系杂交水稻、光敏不育系水稻等。目前现代育种的新途径是通过分子生物学手段对某些功能基因在花粉中进行特异表达。因此首先需要找到在花粉发育和传粉受精过程中特异表达的高效启动子，这种方法才能够得到应用。此外在研究植物受精过程中花粉管功能方面，稳定的花粉标记显得尤为重要。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种拟南芥花粉启动子表达载体及其构建方法与应用，该方法所构建的启动子表达载体可以作为一种分析植物双受精过程的的工具，即可以作为花粉管的标记；另外，该启动子表达载体可以启动相关基因在花粉中特异表达，为创制雄性不育材料提供便利。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0005]一种拟南芥花粉启动子表达载体的构建方法，克隆拟南芥基因AT3G07070启动子和蛋白编码区序列，其序列如SEQ ID No.1所示；利用Gateway技术构建AT3G07070启动子连接蛋白和GUS报告基因的表达载体。
[0006]另一方面本专利技术还提供上述拟南芥花粉启动子表达载体的构建方法构建得到的拟南芥花粉启动子表达载体。
[0007]另一方面本专利技术还提供含有上述拟南芥花粉启动子表达载体的工程菌。
[0008]另一方面本专利技术还提供含有上述拟南芥花粉启动子表达载体在转基因植物中的应用，所述转基因植物经过筛选、鉴定后，获得具有GUS信号的转基因植物。
[0009]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0010]本专利技术对拟南芥基因启动子AT3G07070启动子和蛋白进行克隆与GUS表达载体进行连接，并转化到植物中进行研究，对筛选到的植物进行分析发现GUS基因特异地在花粉和花粉管中表达，转基因材料可以用于花粉的观察和研究。此外，本专利技术提供的启动子还可以连接其他基因，创制更多与花粉发育相关的遗传材料，这些在生产中都具有重要的意义。
附图说明
[0011]图1为本专利技术实施例1中AT3G07070g::GUS载体图谱；
[0012]图2为本专利技术实施例3中观察的转基因拟南芥花序GUS染色图片，其中，图a为花序整体图片、图b为开放花图片、图c为单个花药图片、图d为成熟花粉粒图片、图e为雌蕊柱头
花粉管图片、图f为花粉管进入胚珠图片。
具体实施方式
[0013]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。
[0014]除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备均为本
常规试剂、方法和设备，以下实施例所用原料均为市购。
[0015]实施例1
[0016]拟南芥AT3G07070基因序列的获得以及植物表达载体的构建。
[0017]登录拟南芥信息资源数据库网站https://www.arabidopsis.org/，找到AT3G07070基因的序列，选取起始密码子之前1541bp的序列定义为该基因的启动子区加上蛋白编码序列共3158bp(SEQ ID No.1)，根据设计PCR扩增引物，
[0018]AT3G07070g
‑
F:5'
‑
CACcaacgaataacgatgcttttgcag
‑
3'
[0019]AT3G07070g
‑
R:5'
‑
agaagcacttgggttccgg
‑
3'
[0020]培养野生型拟南芥Col
‑
0，提取拟南芥叶片DNA，随后以DNA为模板扩增目的序列。
[0021]提取植物DNA具体步骤如下：
[0022](1)将培养至三周左右的植物进行编号，用剪刀剪取一片幼嫩的叶片，将其放置在写有对应编号的1.5mL离心管中，在离心管中使用研磨棒将其充分研磨；
[0023](2将400μL提取液加入离心管中，进一步研磨后，取出研磨棒，将提取液放置于振荡器中进行充分振荡混匀，室温下13000rpm离心5分钟；
[0024](3)取大量1.5mL离心管进行编号，分别与之前提取液编号相对应，加入300μL异丙醇，然后将对应编号的提取液上清倒入这些离心管中，注意尽量不要倒入沉淀，轻轻颠倒混匀，4℃或
‑
20℃至少放置30分钟；
[0025](4)室温下13000rpm离心10分钟，倒掉上清液；
[0026](5)在这些离心管中分别加入300μL 70％乙醇，颠倒混匀；
[0027](6)室温下13000rpm离心3分钟，倒掉乙醇；
[0028](7)将离心管开盖，在室温下放置一段时间，待乙醇全部挥发后，加入60μL双蒸水回溶。
[0029]植物DNA提取液配方：
[0030][0031]获得拟南芥AT3G07070的启动子序列：按照Phusion高保真克隆酶扩增体系和反应程序进行PCR。将PCR产物克隆到连接pENTR/D/TOPO vector入门载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将AT3G07070启动子构建到植物表达载体pMDC163上，pMDC163从公司购买获得，最终获得载体AT3G07070g::GUS(图1)，该载体全序列如SEQ ID No.2所示。
[0032]实施例2转基因拟南芥植株的获得
[0033]将植物培养至开花期，随后用农杆菌蘸花法进行转化，待完成种子收取后进行转基因植物的筛选。
[0034]拟南芥种子表面消毒及培育的方法如下：
[0035](1)用筛子筛去多余杂质仅保留种子并将种子分装到1.5mL离心管中，在超净台中用70％乙醇(用灭菌的吐温水配制)处理5分钟，再用2.6％NaClO(用灭菌的吐温水配制)处理10分钟，随后用灭菌的吐温水漂洗四次，然后将种子均匀地铺在1/2MS固体培养基上；
[0036](2)将固体培养基放入4℃冰箱春化3天，然后再放在长日照光照的培养箱中培养4天以上，等到种子萌发并且长出较大真叶即可把小苗移栽到温室中；
[0037](3)在营养钵中装满蛭石，然后将营养钵放在大培养盆中，一个培养盆可以放20钵；向培养盆中浇适量的含有花多多肥料的营养液，蛭石完全被营养液浸透后即可开始移栽小苗；
[0038](4)用镊子在蛭石表面戳几个小洞，然后挑选生长情况良好的小苗，轻轻托着小苗子叶放进小洞中，用蛭石盖住小苗根部和下胚轴，仅在蛭石外暴露两片子叶；每个营养钵中移栽五棵幼苗，移栽完后用透明保鲜膜盖住整个营养盆，起到保湿的作用，在保鲜膜上再剪几个孔以便透气；
[0039](5)幼苗成活后，待幼苗生长至三周左右本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种拟南芥花粉启动子表达载体的构建方法，其特征在于，克隆拟南芥基因AT3G07070启动子和蛋白编码区序列，其序列如SEQ ID No.1所示；利用Gateway技术构建AT3G07070启动子连接蛋白和GUS报告基因的表达载体。2.根据权利要求1所述的一种拟南芥花...

【专利技术属性】
技术研发人员：万智远，郭苏娴，孙孜怡，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：