一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用，属于细胞工程种苗繁殖技术领域。本发明专利技术以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗，缩短了莴苣的转化流程，使农杆菌侵染效率可以达到100％。同时对得到的莴苣再生苗进行驯化，缩短了莴苣从瓶苗驯化到结种子的时间，成活率可达100％。成活率可达100％。成活率可达100％。

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞工程种苗繁殖
，尤其涉及一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用。

技术介绍

[0002]莴苣(Lactuca sativa L.)属于菊科莴苣属的植物，分为茎用莴苣和叶用莴苣两类。莴笋和生菜分别是茎用莴苣和叶用莴苣的代表。莴笋和生菜是常见的叶类蔬菜，目前育种主要采用分子标记育种和传统的杂交育种。基因编辑是一种快速对基因和性状进行定向改良的方法，但是莴苣目前的遗传转化方法效率很低(通常<5％)，因此提高莴苣的遗传转化效率对于创制优质莴苣育种材料有着重要的意义。此外传统的莴笋繁种一般分为春秋两季，不合适的气候条件为再生苗的培育增加了难度，严重限制了莴苣的繁种速度，因此，如何加快莴苣的生育周期，提高莴苣育种速率也是本领域要解决的关键问题之一。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，缩短了莴苣的转化流程，加快了莴苣的生育周期，提高了莴苣育种速率。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，所述方法包括：以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗。
[0006]优选的，莴苣种子于育苗培养基中培养得到莴苣苗。
[0007]优选的，所述育苗培养基为：1/2MS培养基+0～10g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH为5.8。
[0008]优选的，孵育培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH为5.8。
[0009]优选的，筛选培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.1mg/L6
‑
BA+0.05mg/LNAA+200mg/L特美汀+50～70mg/L硫酸卡那霉素；pH为5.8。
[0010]优选的，生根培养基为：1/2MS培养基+10g/L蔗糖+7g/L琼脂+100mg/L特美汀+50～70mg/L硫酸卡那霉素；pH为5.8。
[0011]优选的，将第一次孵育培养的外植体悬浮于含有农杆菌的农杆菌侵染培养基中，使农杆菌侵染外植体；所述农杆菌侵染培养基为：1/2MS培养基+10g/L蔗糖+200μmol/L乙酰丁香酮；pH为5.8。
[0012]优选的，莴苣再生苗移植于泥炭土：珍珠岩质量比为5:1的培养基质中驯化。
[0013]本专利技术还提供了上述转化方法在莴苣扩繁和/或优异性状保持中的应用。
[0014]本专利技术还提供了上述转化方法在莴苣品种改良中的应用。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016]本专利技术通过优化莴苣的遗传转化方法，选择合适的外植体以及侵染方法，使农杆菌侵染效率可以达到100％；从侵染到第一批苗子生根驯化56天，大大缩短了莴笋/生菜的
转化流程。
[0017]本专利技术对得到的莴苣再生苗进行驯化，缩短了莴苣从瓶苗驯化到结种子的时间，通过优化植物工厂的光环境和温度环境，加快了莴苣的繁种速率，使得莴笋育种不再受到季节的限制，并且成活率可达100％，缩短莴苣从瓶苗驯化到结种子时间至4个月。
附图说明
[0018]图1：外植体；
[0019]图2：外植体制备示意图；
[0020]图3：7天后形成愈伤组织图；
[0021]图4：14天后产生幼芽图；
[0022]图5：再生苗生根培养图；
[0023]图6：再生苗驯化示意图；
[0024]图7：育苗盘。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，所述方法包括：以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗。
[0026]本专利技术所述莴苣包括莴笋、生菜。
[0027]本专利技术所述莴苣苗由莴苣种子于育苗培养基中培养得到。作为可选的实施方式，本专利技术将莴苣种子置于2ml离心管中，然后在超净工作台中先用75％乙醇消毒1～2min，无菌蒸馏水冲洗2～3次，再用10％次氯酸钠溶液，消毒8～10min，无菌蒸馏水冲3～5次，用无菌滤纸片吸干种子表面水分。本专利技术将处理过的种子种植于育苗培养基上，于光照培养室培养，温度25℃、光照16/8h(光照/黑暗)，光照强度60μmol
·
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‑2·
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‑1。
[0028]本专利技术所述育苗培养基为：1/2MS培养基+0～10g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH为5.8。本专利技术减少了培养基盐分浓度和蔗糖的用量，以避免高浓度盐分和蔗糖对瓶苗的胁迫。本专利技术所述育苗培养基优选为121℃，110Kpa下灭菌20min。
[0029]本专利技术选择苗龄8～12天的莴苣无菌苗(如图1所示，长出两片真叶，且第二片真叶刚刚露出)，用手术刀将第一片真叶切成两到三段，大小约为0.5cm2，放置在孵育培养基中进行第一次孵育，所述孵育条件为黑暗孵育18～22h；所述苗龄优选为9～11天，更优选为10天；所述孵育时间优选为19～21h，更优选为20h。本专利技术中，莴苣无菌苗真叶叶片很薄，切苗之后立即放置在孵育培养表面保持水分，切苗期间切忌外植体长期暴露在空气中导致失水以影响外植体侵染能力。本专利技术通过选择第一片真叶作为外植体，较传统的莴苣子叶为外植体而言，侵染率更高，产生愈伤组织的时间较短，愈伤组织分化成苗的比例更高。
[0030]本专利技术将第一次孵育培养的外植体从培养皿上取出，悬浮于含有农杆菌的农杆菌侵染培养基中，使农杆菌侵染外植体。作为可选的实施方式，本专利技术将外植体悬浮在装有农杆菌的侵染培养基的离心管中20～30min，中间不断摇晃，保证叶片和菌液充分接触，然后用镊子将外植体从侵染培养基中取出，转移至无菌水清洗，在无菌滤纸上面除去多余水分，得到农杆菌侵染的外植体。
[0031]在本专利技术中，作为可选的实施方式，农杆菌侵染液的制备方法为：挑含有目的基因质粒的农杆菌单克隆于3～5ml LB培养基中，加入抗生素于28℃条件下在180rpm摇床培养16h，然后取50μl菌液加到新的50ml LB培养基，并加入抗生素，28℃，180rpm培养16h，OD
600
值为0.3～0.5时4℃4000rpm离心20min收集菌体，弃去上清。菌体重新悬浮于农杆菌侵染培养基中，调整OD
600
值为0.2～0.4，然后室温(25℃)黑暗条件下静置4～6h，用于侵染莴苣外植体。
[0032]本专利技术所述农杆菌侵染培养基为：1/2MS培养基+10g/L蔗糖+200μmol/L乙酰丁香酮；pH为5.8。本专利技术将1/2MS培养基+10g/L蔗糖于121℃，110Kpa下灭菌20min，待温度降至室温条件下加入200μmol/L乙酰丁香酮，得到农杆菌侵染培养基。
[0033]本专利技术将农杆菌侵染的外植本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括：以苗龄8～12天的莴苣苗真叶为外植体进行第一次孵育培养、农杆菌侵染、第二次孵育培养、筛选培养、生根培养，得到莴苣再生苗。2.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，莴苣种子于育苗培养基中培养得到莴苣苗。3.根据权利要求2所述的转化方法，其特征在于，所述育苗培养基为：1/2MS培养基+0～10g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH为5.8。4.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，孵育培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH为5.8。5.根据权利要求1所述的转化方法，其特征在于，筛选培养基为：MS培养基+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.1mg/L6
‑
BA+0.05mg/LNAA+200mg/L特美汀+5...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁颖，张泽锦，唐丽，
申请(专利权)人：四川省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：