一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于I型CRISPR
‑
Cas系统的优化型基因表达调控工具及应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种
CRISPR
‑
Cas
系统，特别涉及基于
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统的优化型基因表达调控工具及应用
。
(二)
技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas
系统在原核生物中能够抵御外源移动基因元件的入侵，是一种高效的基因编辑和调控工具，现已广泛应用于基因工程
。
自然界中存在六种类型的
(I
～
VI)CRISPR
‑
Cas
系统，其中
II
型
CRISPR
‑
Cas9
系统源于化脓性链球菌，应用最广泛，效应蛋白
Cas9
在
sgRNA
的介导下识别并切割靶标
DNA
上含原间隔区相邻基序
(PAM)
的与
sgRNA
互补
DNA
序列
。Cas9
核酸酶的突变体
dCas9
丧失了核酸酶的功能，但可与靶向位置结合
。
将
dCas9
引导至启动子或启动子下游的非模板链区域可干扰基因转录，实现基因表达沉默
。
近年来，
CRISPR
‑
Cas/>系统因具有操作方便，编辑效率高，适用范围广泛等优点，使其在不同的生物中都得到了应用
。
目前，基于
II
型
CRISPR
‑
dCas9
系统的基因表达调控工具已广泛应用于原核和真核生物中，但表达该系统会对宿主细胞造成较大的代谢负担和细胞毒性，其中
PAM
位点的选择类型也相对较少，在有限选择的
PAM
位点局限下还存在脱靶问题
。
[0003]I
型
CRISPR
‑
Cas
系统是一种来源于大肠杆菌的内源
CRISPR
‑
Cas
系统，亲缘关系更近的内源系统表达往往优于异源系统，更有利于宿主菌生长
。
相较于
II
型
CRISPR
‑
Cas
系统，
I
型系统脱靶情况出现较少，所能识别的
PAM
位点种类更多
。
虽然
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统广泛存在于细菌中，但利用
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统开发基因表达调控工具的研究较少
。I
型
CRISPR
‑
Cas
系统中，成熟
crRNA
与
CasA
‑
D
蛋白形成的
Cascade
‑
crRNA
复合物可结合在靶标
DNA
上特定位置并招募
Cas3
蛋白切割
DNA。Cas3
缺失导致
Cascade
‑
crRNA
复合物保留了与靶向
DNA
结合的能力，可结合在靶标位置，阻碍基因转录
。
[0004]以大肠杆菌为细胞工厂生产代谢产物已成为生产产品的重要方式，利用基因敲除技术敲除代谢路线中的阻遏基因，可以使产品生成最大化，但基因敲除技术时间周期相对较长，代谢路线错综复杂，增加了构建高产底盘菌的难度，且无法实现对目标基因在特定时间范围内的精准调控
。
使用基因调控工具，选择性地控制胞内基因不同生长时期差异性表达可以扩大底盘生物的利用范围，提高目的代谢产物的合成水平
。
[0005]E.coli Nissle 1917(EcN)
是一种代表性益生菌，主要应用于治疗肠道炎症
、
改善结肠炎，调节肠道微生物群并拮抗病原体的定植
。
因其安全性和可遗传操作性，逐渐成为体内活菌治疗和重要原料药及其前体的首选底盘微生物，应用前景十分广阔
。
虽然
CRISPR
‑
Cas
介导的基因组编辑和调控技术已经发展了十多年，且应用广泛；但近三年人们才开始在
EcN
中应用
II
型
CRISPR
‑
Cas
系统开展基因编辑工作
。
该菌株中利用
CRISPR
‑
Cas
系统调控基因表达的遗传操作工具仍十分匮乏，这大大限制了其应用范围
。
虽然
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统存在于许多大肠杆菌菌株中，但尚未在
EcN
中发现
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统，也没有在
EcN
中利用其他来源
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统调控基因表达的研究
。
[0006]本专利技术旨在开发高效的
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统介导的基因表达调控工具，并将其应用于筛选影响代谢物
(
如
β
‑
丙氨酸
)
产量的关键代谢基因，锁定有效基因，为后期构建高产底盘菌节省大量时间，从而提高工业生产菌种的开发效率；而且用于控制活菌治疗药物中活性分子的释放，提高活菌治疗药物的疗效和生物安全性
。
(三)
技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种基于
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统的优化型基因表达调控工具及应用，本专利技术采用严谨型启动子
P
J23100
‑
araC
‑
P
ara
诱导表达
Cascade
蛋白，降低其泄漏表达情况，增强其可控性，使调控基因的时间更加明确；将
crRNA
识别序列选择性设计在靶标基因非编码链的翻译起始处或转录起始处，并在基因组或质粒上利用组成型启动子
J23119
表达
crRNA
，在提高靶标识别的同时，增加了
crRNA
的水平，从而提高基因表达调控的高效性
。
同时，通过改变
repeat
长度使原本需要生物公司合成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
I
型
CRISPR
‑
Cas
系统的优化型基因表达调控工具，其特征在于，所述优化型基因表达调控工具包括
Cascade
蛋白和
crRNA
；所述
Cascade
蛋白由严谨型启动子
P
J23100
‑
araC
‑
P
ara
诱导表达；所述
crRNA
由组成型启动子
P
J23119
表达；所述
crRNA
结构为
repeat1
‑
spacer
‑
repeat2
，所述
repeat1
长度为6‑
8bp
；所述
repeat2
长度为
20
‑
29bp
；所述
spacer
选自靶标基因非编码链的翻译起始处或转录起始处，长度为
32bp。2.
如权利要求1所述的优化型基因表达调控工具，其特征在于，组成型启动子
P
J23119
核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。3.
如权利要求1所述的优化型基因表达调控工具，其特征在于，所述
repeat1
核...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东昌，李娜，俞明静，姚夏，胡诗龙，张瑞婷，茅呈耀，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：