编辑活性提高的制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复

【技术实现步骤摘要】
编辑活性提高的Cas蛋白及其应用
[0001]本专利技术为申请日
2023
年2月2日，名称为“编辑活性提高的
Cas
蛋白及其应用”的中国专利申请
CN 2023100884374
的分案申请
。


[0002]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复
(CRISPR)


。
具体而言，本专利技术涉及一种编辑活性提高的
Cas
蛋白及其应用
。

技术介绍

[0003]CRISPR/Cas
技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过
RNA
引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割
DNA
产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑
。
[0004]CRISPR/Cas9
系统是最常用的
II
型
CRISPR
系统，它识别3’‑
NGG
的
PAM
基序，对靶标序列进行平末端切割
。CRISPR/Cas Type V
系统是一类新发现的
CRISPR
系统，它具有5’‑
TTN
的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如
Cpf1,C2c1,CasX,CasY。
然而目前存在的不同的
CRISPR/Cas
各有不同的优点和缺陷
。
例如
Cas9,C2c1
和
CasX
均需要两条
RNA
进行指导
RNA
，而
Cpf1
只需要一条指导
RNA
而且可以用来进行多重基因编辑
。CasX
具有
980
个氨基酸的大小，而常见的
Cas9
，
C2c1
，
CasY
和
Cpf1
通常大小在
1300
个氨基酸左右
。
此外，
Cas9
，
Cpf1
，
CasX
，
CasY
的
PAM
序列都比较复杂多样，而
C2c1
识别严谨的5’‑
TTN
，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应
。
[0005]中国专利技术专利申请
CN114672473A
中公开了一种氨基酸产生突变的
Cas
蛋白，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，本申请通过蛋白进化，进一步提高了该蛋白在真核细胞中的编辑范围，扩展了其应用范围
。

技术实现思路

[0006]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对
Cas
蛋白的定点突变和优化组合，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围
。
[0007]Cas
效应蛋白
[0008]一方面，本专利技术提供了一种编辑活性提高的
Cas
突变蛋白，所述突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第
233
位
、
第
267
位
、
第
369
位
、
第
433
位
、
第
168
位
、
第
328
位
、
第
505
位
。
[0009]在一个实施方式中，所述编辑活性提高的
Cas
突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第
233
位
、
第
267
位
、
第
369
位
、
第
433
位
、
第
168
位
、
第
328
位
、
第
505
位；所述任意几个选自：任意2个
、
任意3个
、
任意4个
、
任意5个
、
任意6个或7个
。
[0010]在优选的实施方式中，所述编辑活性提高的
Cas
突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：
[0011]第
168
位氨基酸；
[0012]或，第
233
位氨基酸；
[0013]或，第
168
位氨基酸和第
267
位氨基酸同时突变；
[0014]或，第
168
位氨基酸和第
505
位氨基酸同时突变；
[0015]或，第
233
位氨基酸和第
267
位氨基酸同时突变；
[0016]或，第
233
位氨基酸和第
505
位氨基酸同时突变；
[0017]或，第
233
位氨基酸
、
第
369
位氨基酸和第
433
位氨基酸同时突变；
[0018]或，第
233
位氨基酸
、
第
267
位氨基酸
、
第
328
位氨基酸和第
369
位氨基酸同时突变；
[0019]或，第
233
位氨基酸
、
第
267
位氨基酸
、
第
369
位氨基酸和第
433
位氨基酸同时突变；
[0020]或，第
168
位氨基酸
、
第
267
位氨基酸
、
第
328
位氨基酸和第
369
位氨基酸同时突变
。
[0021]在一个实施方式中，所述第
168
位氨基酸突变为非
N
的氨基酸，例如，
A
，
V
，
G
，
L
，
Q
，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Cas
突变蛋白，所述
Cas
突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第
233
位
、
第
267
位
、
第
369
位
、
第
433
位
、
第
168
位
、
第
328
位
、
第
505
位
。2.
根据权利要求1所述的
Cas
突变蛋白，其特征在于，所述
Cas
突变蛋白与亲本
Cas
蛋白的氨基酸序列相比，在对应于
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：第
233
位氨基酸发生突变；或，第
233
位氨基酸和第
267
位氨基酸同时突变；或，第
233
位氨基酸
、
第
369
位氨基酸和第
433
位氨基酸同时突变；或，第
233
位氨基酸和第
505
位氨基酸同时突变；或，第
233
位氨基酸
、
第
267
位氨基酸
、
第
328
位氨基酸和第
369
位氨基酸同时突变；或，第
168
位氨基酸发生突变；或，第
168
位氨基酸和第
267
位氨基酸同时突变；或，第
168
位氨基酸和第
505
位氨基酸同时突变；或，第
168
位氨基酸
、
第
267
位氨基酸
、
第
328
位氨基酸和第
369
位氨基酸同时突变
。3.
根据权利要求1或2所述的
Cas
突变蛋白，其特征在于，所述
Cas
突变蛋白选自以下
i
‑
iii
任意一组：
i、
由
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的
Cas
突变蛋白：第
233
位
、
第
267
位
、
第
369
位
、
第
433
位
、
第
168
位
、
第
328
位
、
第
505
位；
ii、
与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有
I
中所述的突变位点；并且，与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
、
至少
99.1
％
、
至少
99.2
％
、
至少
99.3
％
、
至少
99.4
％
、
至少
99.5
％
、
至少
99.6
％
、
至少
99.7
％
、
至少
99.8
％
、
或至少
99.9
％的序列同一性的
Cas
突变蛋白；
iii、
与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有
I
中所述的突变位点；并且，与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有一个或多个氨基酸的置换
、
缺失或添加的序列；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或
10
个氨基酸的置换
、
缺失或添加
。4.
根据权利要求1或2所述的
Cas
突变蛋白，其特征在于，所述
Cas
突变蛋白选自以下
I
‑
III
任意一组：
I、
由
SEQ ID No.1
所示氨基酸序列在包含以下任一或任意几个氨基酸位点处产生突变得到的
Cas
突变蛋白：第
233
位
、
第
267
位
、
第
369
位
、
第
433
位
、
第
168
位
、
第
328
位
、
第
505
位；并且，所述
Cas
突变蛋白在对应于
SEQ ID No.1
的第7位
、
第
233
位
、
第
267
位
、
第
369
位
、
第
433
位
、
第
168
位
、
第
328
位或第
505
位的任一或任意几个氨基酸位点为精氨酸
(R)
；
II、
与
I
所述的
Cas
突变蛋白相比，具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
、
至少
99.1
％
、
至少
99.2
％
、
至少
99.3
％<...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚峰，段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：