新型制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复

【技术实现步骤摘要】
新型CRISPR酶和系统及应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复
(CRISPR)


。
具体而言，本专利技术筛选到了一类新型的
Cas
酶，并基于该新型
Cas
酶开发了相应的基因编辑工具及其应用
。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas
技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过
RNA
引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割
DNA
产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑
。
[0003]CRISPR/Cas9
系统是最常用的
II
型
CRISPR
系统，它识别3’‑
NGG
的
PAM
基序，对靶标序列进行平末端切割
。CRISPR/Cas Type V
系统是一类新发现的
CRISPR
系统，它具有5’‑
TTN
的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如
Cpf1,C2c1,CasX,CasY。
然而目前存在的不同的
CRISPR/Cas
各有不同的优点和缺陷
。
例如
Cas9,C2c1
和
CasX
均需要两条
RNA
进行指导
RNA
，而
Cpf1
只需要一条指导
RNA
而且可以用来进行多重基因编辑
。CasX
具有
980
个氨基酸的大小，而常见的
Cas9
，
C2c1
，
CasY
和
Cpf1
通常大小在
1300
个氨基酸左右
。
此外，
Cas9
，
Cpf1
，
CasX
，
CasY
的
PAM
序列都比较复杂多样，而
C2c1
识别严谨的5’‑
TTN
，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应
。
[0004]总之，鉴于目前可获得的
CRISPR/Cas
系统都受限于一些缺陷，开发一种更稳健的
、
具有多方面良好性能的新型
CRISPR/Cas
系统对生物技术的发展具有重要意义
。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一种新型核酸内切酶
(Cas
酶
)。
基于这一发现，本专利技术人开发了新的
CRISPR/Cas
系统以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法
。
[0006]Cas
效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一种
Cas
蛋白，所述
Cas
蛋白是
CRISPR/Cas
系统中的效应蛋白，在本专利技术中，将其称为
Cas
‑
sf2222
，上述蛋白的氨基酸序列分别如
SEQ ID No.1
所示
。
[0008]在一个实施方式中，所述
Cas
蛋白氨基酸序列与
SEQ ID No.1
所示序列相比具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
、
至少
99.1
％
、
至少
99.2
％
、
至少
99.3
％
、
至少
99.4
％
、
至少
99.5
％
、
至少
99.6
％
、
至少
99.7
％
、
至少
99.8
％
、
或至少
99.9
％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能
。
优选的，所述
Cas
蛋白与
Cas
‑
sf2222
来源于同一物种
。
[0009]在一个实施方式中，所述
Cas
蛋白氨基酸序列与
SEQ ID No.1
所述序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换
、
缺失或添加的序列；并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；所述一个或多个氨基酸的置换
、
缺失或添加包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或
10
个氨基酸的置换
、
缺失或添加
。
优选的，所述
Cas
蛋白与
Cas
‑
sf2222
来源于同一物种
。
[0010]本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和
/
或三维结构产生不利影响
。
本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式
。
具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基
。
这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的
。
只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本专利技术的范围内
。
因此，本专利技术的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代
,
这些保守性取代最好根据下表进行替换而产生
。
另外，本专利技术也涵盖还包含一个或多个其他非保守本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
Cas
蛋白，其特征在于，所述
Cas
蛋白为以下
I
‑
III
任一所述的
Cas
蛋白：
I、Cas
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID No.1
所示序列相比，具有至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
91
％
、
至少
92
％
、
至少
93
％
、
至少
94
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
、
至少
99.1
％
、
至少
99.2
％
、
至少
99.3
％
、
至少
99.4
％
、
至少
99.5
％
、
至少
99.6
％
、
至少
99.7
％
、
至少
99.8
％
、
或至少
99.9
％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；
II、
所述
Cas
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID No.1
所示序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换
、
缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；
III、
所述
Cas
蛋白包含
SEQ ID No.1
所示的氨基酸序列
。2.
一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的
Cas
蛋白和其他的修饰部分
。3.
一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述
Cas
蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列
。4.
一种
gRNA
，其特征在于，所述
gRNA
能够结合权利要求1所述的
Cas
蛋白，所述
gRNA
包括
tracrRNA
和
crRNA
，所述
tracrRNA
和
crRNA
能够配对形成双链体，所述
crRNA
包括与
tracrRNA
的配对区以及靶向核酸的靶向序列，所述
crRNA
与
tracrRNA
的配对区的序列包含
SEQ ID No.5
‑6任一所示的序列，所述
tracrRNA
序列包含
SEQ ID No.4
所示的序列
。5.
一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件
。6.
一种
CRISPR
‑
Cas
系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的
Cas
蛋白以及至少一种权利要求4所述的
gRNA。7.
一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：
a)
第一调控元件，该第一调控元件可操作地与权利要求4所述的
gRNA
连接，
b)
第二调控元件，该第二调控元件可操作地与权利要求1所述的
Cas
蛋白连接；其中组分
(a)
和
(b)
位于该系统的相同或不同载体上
。8.
一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：
(i)
蛋白组分，其选自：权利要求1所述的
Cas
蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；
(ii)
核酸组分，其选自：权利要求4所述的
gRNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的核酸，或权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
核酸；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物
。9.
一种活化的
CRISPR
复合物，所述活化的
CRISPR
复合物包含：
(i)
蛋白组分，其选自：权利要求1所述的
Cas
蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；
(ii)
核酸组分，其选自：权利要求4所述的
gRNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的核酸，或权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
，或编码权利要求4所述的
gRNA
的前体
RNA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，赵庆芝，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：