一种基因编辑蛋白、其相应的基因编辑系统及应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基因编辑蛋白、其相应的基因编辑系统及应用，具体地，本发明专利技术的基因编辑蛋白在体外显示出了非常好的基因编辑活性，可对靶基因进行有效编辑或切割，可有效治疗有需要的受试者的病症或疾病。需要的受试者的病症或疾病。

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑蛋白、其相应的基因编辑系统及应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，具体地，涉及一种基因编辑蛋白、其相应的基因编辑系统及应用。

技术介绍

[0002]Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)系统是细菌和古细菌为了防御入侵噬菌体的DNA而形成的。CRISPR系统包括2个家族，1类系统进一步分为I型、III型和IV型；2类系统分为II型、V型和VI型。这6种系统类型又细分为19种亚型。许多原核生物包含多个CRISPR
‑
Cas系统,这表明它们是兼容的并且可能共享组件。
[0003]其中II型最常见的为CRISPR/Cas9系统，Cas9蛋白可在反式编码小RNA(tracrRNA)的协助下将pre
‑
crRNA加工成与tracrRNA结合的成熟crRNA。之后，人们发现通过人工构建模拟crRNA
‑
tracrRNA复合体的单链嵌合体引导RNA(guide RNA，gRNA)，即可有效的介导Cas9蛋白对靶点的识别和切割。其中与靶点3
′
端紧邻的3个碱基必须是5
′‑
NGG
‑3′
的形式，从而构成Cas/crRNA复合体识别靶点所需的PAM(protospacer adjacent motif)结构。
[0004]目前已知的CRISPR/Cas存在各自的优缺点，例如，Cas9需要两条RNA作为指导RNA。
[0005]目前对于具有广泛应用价值的靶向核酸或多核苷酸的替代性且稳健的编辑系统和编辑技术存在着迫切需要。
[0006]因此，目前对生物技术的发展仍需要开发新的、具有多样化特征的新型CRISPR/Cas系统。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的在于提供一种新的、具有多样化特征的新型CRISPR/Cas系统。
[0008]本专利技术的另一目的在于发掘出新的CRISPR
‑
Cas系统，提供用于靶向核酸或多核苷酸的替代且稳健的系统和技术，以解决目前已知的CRISPR
‑
Cas系统的缺点。
[0009]本专利技术的第一方面提供了一种基因编辑蛋白，所述蛋白选自下组：
[0010](a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；
[0011](b)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％同源性(或同一性)的多肽，且所述多肽具有SEQ ID NO:1的生物学功能；
[0012](c)将SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列经过一个或多个(较佳地，1
‑
20个，更佳地为1
‑
10个、更佳地1
‑
5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留SEQ ID NO:1的生物学功能的衍生多肽。
[0013]在另一优选例中，所述基因编辑蛋白是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白。
[0014]本专利技术第二方面提供了一种融合蛋白，包含本专利技术第一方面所述的基因编辑蛋白；以及一个或多个功能结构域。
[0015]在另一优选例中，所述功能结构域选自定位信号、报告蛋白、Cas蛋白靶向部分、
DNA结合域、表位标签、转录激活域、转录抑制域、核酸酶、脱氨结构域、甲基化酶、脱甲基酶、转录释放因子、HDAC、裂解活性多肽、连接酶、整合酶、转座酶、重组酶、聚合酶和碱基切除修复抑制剂(如尿嘧啶
‑
DNA糖基化酶抑制剂(UGI))。
[0016]在另一优选例中，所述功能结构域包括以下一种或多种对靶序列的酶活性：甲基化酶活性、脱甲基酶活性、乙酰基转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性、脱豆蔻酰化活性、糖基化活性(例如，来自O
‑
GlcNAc转移酶)和脱糖基化活性。
[0017]在另一优选例中，所述功能结构域选自腺苷脱氨酶催化结构域或胞苷脱氨酶催化结构域。
[0018]在另一优选例中，所述腺苷脱氨酶催化结构域或胞苷脱氨酶催化结构域包括ADAR1、ADAR2、APOBEC、AID或TAD中的一种或多种。
[0019]在另一优选例中，所述功能结构域是TadA8e的全长或功能性片段。
[0020]在另一优选例中，所述定位信号包括核定位信号(NLS)和/或核输出信号(NES)。
[0021]在另一优选例中，所述核定位信号的序列位于、靠近或接近权利要求1所述的蛋白的末端(例如，N端或C端)。
[0022]在另一优选例中，所述核输出信号包括蛋白酪氨酸激酶2(如人蛋白酪氨酸激酶2)。
[0023]在另一优选例中，所述报告蛋白包括谷胱甘肽
‑
S
‑
转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
葡糖醛酸糖苷酶、自发荧光蛋白。
[0024]在另一优选例中，所述自发荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP
‑
2、tagGFP、turboGFP、eGFP、CopGFP、AceGFP等)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(例如，eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl等)、黄色荧光蛋白(例如，(例如，YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP等)、蓝色荧光蛋白(例如，eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T
‑
sapphire)。
[0025]在另一优选例中，所述DNA结合域包括甲基化结合蛋白、LexADBD、Gal4DBD。
[0026]在另一优选例中，所述表位标签包括组氨酸标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素标签、Myc标签、VSV
‑
G标签、硫氧还蛋白标签、链霉亲和素标签。
[0027]在另一优选例中，所述转录激活域包括VP64和/或VPR。
[0028]在另一优选例中，所述转录抑制域包括KRAB和/或SID。
[0029]在另一优选例中，所述核酸酶包括FokI。
[0030]在另一优选例中，所述裂解活性多肽包括具有单链RNA裂解活性的多肽、具有双链RNA裂解活性的多肽、具有单链DNA裂解活性的多肽或具有双链DNA裂解活性的多肽。
[0031]在另一优选例中，所述连接酶包括DNA连接酶和/或RNA连接酶。
[0032]在另一优选例中，所述功能结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑蛋白，其特征在于，所述蛋白选自下组：(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；(b)具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列≥80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％同源性(或同一性)的多肽，且所述多肽具有SEQ ID NO:1的生物学功能；(c)将SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列经过一个或多个(较佳地，1
‑
20个，更佳地为1
‑
10个、更佳地1
‑
5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留SEQ ID NO:1的生物学功能的衍生多肽。2.一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的基因编辑蛋白；以及一个或多个功能结构域。3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的基因编辑蛋白或权利要求2所述的融合蛋白。4.一种分离的核酸分子，其特征在于，包含选自下列的序列，或由选自下列的序列组成：(i)SEQ ID NO：3所示的序列；(ii)与SEQ ID NO：3所示的序列相比具有一个或多个碱基的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个碱基的置换、缺失或添加)的序列；(iii)与SEQ ID NO：3所示的序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的序列同一性的序列；(iv)在严格条件下与(i)
‑
(iii)任一项中所述的序列杂交的序列；或(v)(i)
‑
(iii)任一项中所述的序列的互补序列；并且，(ii)
‑
(v)中任一项所述的序列基本保留了其所源自的序列的生物学功能；例如，所述分离的核酸分子是RNA；例如，所述分离的核酸分子包含CRISPR/Cas系统中的同向重复序列。5.一种向导RNA(gRNA)，其特征在于，所述向导RNA包括能够结合权利要求1所述基因编辑蛋白的同向重复(Direct Repeat，DR)序列和能够靶向靶序列的间隔(spacer)序列。6.一种复合物，其特征在于，包含：(i)蛋白组分，选自下组：权利要求1所述的基因编辑蛋白、权利要求2所述的融合蛋白、或其组合；和(ii)核酸组分，选自下组：权利要求5所述的向导RNA，编码权利要求5所述的向导RNA的核酸，权利要求5所述的向导RNA的前体RNA，编码权利要求5所述的向导RNA的前体RNA核酸、或其组合；其中，所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。7.一种载体，其特征在于，包含权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的核酸分子。8.一种CRISPR
‑
Cas组合物，其特征在于，包含：(i)第一组分，选自下组：权利要求1所述的基因编辑蛋白、权利要求2所述的融合蛋白、编码权利要求1所述的基因编辑蛋白或权利要求2所述的融合蛋白的核苷酸序列，以及其任意组合；和
(ii)第二组分，所述第二组分为包含一种或多种权利要求5所述的向导RNA，或者编码所述包含一种或多种权利要求5所述的向导RNA的核苷酸序列；所述向导RNA能够与(i)中所述的蛋白或蛋白变体或融合蛋白形成复合物。9.一种CRISPR
‑
Cas系统，其特征在于，包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(i)第一核酸，其为编码权利要求1所述的基因编辑蛋白或权利要求2所述的融合蛋白的核苷酸序列；任选地所述第一核酸可操作地连接至第一调节元件；以及(ii)第二核酸，其编码包含权利要求5所述的向导RNA的核苷酸序列；任选地所述第二核酸可操作地连接至第二调节元件；其中：所述第一核酸与第二核酸存在于相同或不同的载体上；所述向导RNA能够与(i)中所述的蛋白或融合蛋白形成复合物。10.一种试剂盒，其特征在于，包括一种或多种选自下列的组分：权利要求1所述的基因编辑蛋白、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求6所述的复合物、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的CRISPR
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Cas组合物或权利要求9所述的系统。11.一种递送组合物，其特征在于，包含递送载体，以及选自下列的一种或多种：权利要求1所述的基因编辑蛋白、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的多核苷酸、权利要求6所述的复合物、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的CRISPR
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Cas组合物或权利要求9...

【专利技术属性】
技术研发人员：王威，李昌盛，
申请(专利权)人：尧唐上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：