【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，具体涉及一种微流控数字pcr芯片及其制备方法。
技术介绍
1、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制。现已广泛应用到基因检测、基因扩增、基因工程等分子生物学领域，并且在临床医学、法医学、亲子鉴定以及环境检测等方面发挥着不可替代的作用。然而pcr反应以指数级扩增，在几十分钟内即可扩增百万倍，难于通过pcr产物确定原始pcr模板的浓度。
2、数字pcr(dpcr)的基本原理是将pcr样品等量分配到数量众多不同的微反应单元，每个微反应单元包含不同数目的模板分子，在每个反应单元中完成独立的pcr扩增。扩增结束后，包含模板分子的微反应单元会有荧光信号记为阳性，不包含模板分子的微反应单元则不会有荧光信号，因此记为阴性。不同微反应单元中的模板数量符合泊松分布，因此可以通过计数阳性以及阴性微反应单元的数量，根据公式准确得知初始样品中pcr模板的浓度。微反应单元的反应单元数量、体积精度、均一度以及微反应单元的反应质量决定了整个dpcr的质量。现有dpcr系统主要包含阀门式dpcr芯片、油包水微滴式dpcr芯片和开放式阵列dpcr芯片。这些芯片成本高，操作复杂。其中有的芯片还存在热反应慢、体积准确度、均一度差等问题。目前利用上述性能进行上样，需要使用额外的精密仪器，使操作流程变得繁琐，限制性大。
3、目前，核酸扩增以及检测芯片领域，操作流程繁琐、主要体现在以下方面：
5、2.传统数字pcr芯片厚度大，光线透射率较低，对后续数学分析造成一定偏差；
6、3.受限于数字pcr芯片的制作工艺，较厚的芯片主体使成本升高，造成结构冗余。
技术实现思路
1、本专利技术针对
技术介绍
中的不足，提供一种手动操作的微流控数字pcr芯片，
2、为解决以上技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术公开了一种手动操作的微流控数字pcr芯片，所述芯片依次设置有基底层、空白层和反应层；所述反应层具有主流道、与所述主流道相连通的各分支流道以及与所述各分支流道相连通的各微反应单元；所述反应层还具有进样口和出样口。
4、在具体的实施方案中，所述进样口与ⅰ级流入道相连通，所述出样口与ⅲ级流出道相连通；所述ⅰ级流入道与所述的ⅱ级流入道、ⅲ级流入道、ⅳ级流入道、纵行微通道依次连通；所述纵行微通道通过缓冲通道与微反应单元相连；所述纵行微通道与ⅰ级流出道，ⅱ级流出道，ⅲ级流出道依次连通。
5、在具体的实施方案中，共有16列纵行微通道，每列设置32行微反应单元，纵行微通道106两侧平行放置两列微反应单元108，共1024个。
6、在具体的实施方案中，芯片整体面积在2cm2；所述进样口、出样口直径为0.36毫米，高度为3-4毫米；所述ⅰ级流入道、ⅱ级流入道、ⅲ级流入道、ⅳ级流入道、ⅰ级流出道，ⅱ级流出道，ⅲ级流出道、宽度为50微米，高度为25微米；所述的纵行微通道与ⅳ级流入道相接后，向芯片后端延伸，宽度为50微米，高度为25微米，长度为10毫米；所述的缓冲通道从纵行微通道侧壁垂直伸出，宽度为50微米，高度为25微米；所述的微反应单元宽度和长度均为150微米，高度为250微米；相应地，在所述的纵行微通道另一侧，前述缓冲通道向靠近加样口一侧100微米处设置有另一侧缓冲通道；所述所有纵行微通道、缓冲通道与微反应单元体积为6mm3，所有流道的体积总和为6.6mm3。
7、在具体的实施方案中，所述空白层和所述反应层采用聚二甲基硅氧烷制成。
8、在具体的实施方案中，所述基底层采用支撑材料制成，具体如玻璃等。
9、第二方面，本专利技术公开了前文所述的手动操作的微流控数字pcr芯片的使用方法，包括以下步骤：
10、s1将进样口与液体暂存试管通过塑料软管相连通、将出样口与注射器通过塑料软管相连通；s2将样本核酸扩增体系放置在液体暂存试管内；
11、s3利用注射器将样本核酸扩增体系吸引至芯片本体内的微反应单元中；
12、s4将隔离油以相同方法吸引至微反应单元；
13、s5将芯片放入pcr仪内进行pcr反应；
14、s6将pcr仪中的数字pcr芯片取出，对数字pcr芯片进行荧光信号分析。
15、塑料软管与前文所述的pcr芯片连接时，要使所述数字pcr芯片的反应层的进样口和出样口与塑料软管对准并紧密贴合。
16、在具体的实施方案中，所述步骤s3中，使用注射器在所述进样器的出样口处向外抽气，使所述样本核酸扩增体系经过所述数字pcr芯片的反应层的进样口流入所述数字pcr芯片的反应层的流道，直至部分所述样本核酸扩增体系经过所述数字pcr芯片的反应层的出样口流出。
17、注射器与出样口连通并拉动后，可以形成负压空间，将样本核酸扩增体系吸引至芯片本体的微反应单元内。
18、在更具体的实施方案中，使用注射器自出样口向外抽气，直至所述样本核酸扩增体系充满与所述ⅰ级流入道，ⅱ级流入道，ⅲ级流入道，ⅳ级流入道，与所述各纵行微通道，缓冲通道，微反应单元。
19、在更具体的实施方案中，所述步骤s4包括以下步骤：吸掉所述出样口处的多余样本核酸扩增体系，并加入隔离油；使用注射器在所述进样器的出样口处抽气，使所述隔离油填满所述反应层的ⅰ级流入道，ⅱ级流入道，ⅲ级流入道，ⅳ级流入道，纵行微通道，缓冲通道，完成对各微反应单元的隔离。
20、在更具体的实施方案中，所述隔离油为fc-40氟化液。
21、第三方面，本专利技术公开了一种制备前文任一项所述的数字pcr芯片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
22、1)清洗硅片，在所述硅片上制作反应层模具；
23、2)将聚二甲基硅氧烷以及固化剂混合均匀并脱气后浇注到所述反应层模具上，热固化形成具有主流道各分支流道以及各微反应单元的聚二甲基硅氧烷膜片；将所述聚二甲基硅氧烷膜片从所述反应层模具上取下并打孔；
24、3)将聚二甲基硅氧烷以及固化剂混合均匀旋涂在硅片上，固化形成空白层；
25、4)将步骤2)获得的反应层与步骤3)获得的空白层一起经等离子体激活处理后键合在一起；
26、5)将步骤4)获得的三层聚二甲基硅氧烷键合结构与基底层经等离子体激活处理后键合在一起，即制成数字pcr芯片。
27、在具体的实施方案中，所述步骤4)中的键合包括键合后在80℃下烘烤1-2h实现永久键合。
28、本专利技术采用以上技术方案后，与现有技术相比，具有以下优点：
29、1、现场手动操作，不需要昂贵的注射泵或芯片制备仪；
30、2、不需要使用高粘度热聚合分离油，进样完成后芯片不需要密封，操作简单；
<本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种手动操作的微流控数字PCR芯片，其特征在于：所述芯片依次设置有基底层(4)、空白层(3)和反应层(2)；所述的反应层(2)设置有进样口(101)和出样口(112)，所述进样口(101)与Ⅰ级流入道(102)相连通，所述出样口(112)与Ⅲ级流出道(111)相连通；
2.根据权利要求1所述的手动操作的微流控数字PCR芯片，其特征在于：所述芯片共有16列纵行微通道(106)，每列设置32行微反应单元(108)，纵行微通道(106)两侧平行放置两列微反应单元(108)，共1024个。
3.根据权利要求1所述的手动操作的微流控数字PCR芯片，其特征在于：芯片整体面积在2cm2；所述进样口(101)、出样口(112)直径为0.36毫米，高度为3毫米；所述Ⅰ级流入道(102)、Ⅱ级流入道(103)、Ⅲ级流入道(104)、Ⅳ级流入道(105)、Ⅰ级流出道(109)，Ⅱ级流出道(110)，Ⅲ级流出道(111)、宽度为50微米，高度为25微米；所述的纵行微通道(106)与Ⅳ级流入道(105)相接后，向芯片后端延伸，宽度为50微米，高度为25微米，长度为10毫米；所述
4.根据权利要求1所述的手动操作的微流控数字PCR芯片，其特征在于：所述空白层(3)和所述反应层(2)采用聚二甲基硅氧烷制成。
5.根据权利要求1所述的手动操作的微流控数字PCR芯片，其特征在于：所述基底层(4)采用支撑材料制成，具体为玻璃。
6.权利要求1-4任一所述的手动操作的微流控数字PCR芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求5所述的手动操作的微流控数字PCR芯片的使用方法，其特征在于：
8.根据权利要求6所述的手动操作的微流控数字PCR芯片的使用方法，其特征在于：使用注射器自出样口向外抽气，直至所述样本核酸扩增体系充满与所述Ⅰ级流入道(102)，Ⅱ级流入道(103)，Ⅲ级流入道(104)，Ⅳ级流入道(105)，与所述各纵行微通道(106)，缓冲通道(107)，微反应单元(108)。
9.权利要求1所述的一种手动操作的微流控数字PCR芯片方法，其特征在于，所述步骤S4包括以下步骤：吸掉所述出样口(112)处的多余样本核酸扩增体系，并加入隔离油；使用注射器在所述进样器的出样口(112)处抽气，使所述隔离油填满所述反应层的Ⅰ级流入道(102)，Ⅱ级流入道(103)，Ⅲ级流入道(104)，Ⅳ级流入道(105)，纵行微通道(106)，缓冲通道(107)，完成对各微反应单元(108)的隔离。
10.一种制备如权利要求1-4任一项所述的数字PCR芯片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种手动操作的微流控数字pcr芯片，其特征在于：所述芯片依次设置有基底层(4)、空白层(3)和反应层(2)；所述的反应层(2)设置有进样口(101)和出样口(112)，所述进样口(101)与ⅰ级流入道(102)相连通，所述出样口(112)与ⅲ级流出道(111)相连通；
2.根据权利要求1所述的手动操作的微流控数字pcr芯片，其特征在于：所述芯片共有16列纵行微通道(106)，每列设置32行微反应单元(108)，纵行微通道(106)两侧平行放置两列微反应单元(108)，共1024个。
3.根据权利要求1所述的手动操作的微流控数字pcr芯片，其特征在于：芯片整体面积在2cm2；所述进样口(101)、出样口(112)直径为0.36毫米，高度为3毫米；所述ⅰ级流入道(102)、ⅱ级流入道(103)、ⅲ级流入道(104)、ⅳ级流入道(105)、ⅰ级流出道(109)，ⅱ级流出道(110)，ⅲ级流出道(111)、宽度为50微米，高度为25微米；所述的纵行微通道(106)与ⅳ级流入道(105)相接后，向芯片后端延伸，宽度为50微米，高度为25微米，长度为10毫米；所述的缓冲通道107从纵行微通道(106)侧壁垂直伸出，宽度为50微米，高度为25微米；所述的微反应单元(108)宽度和长度均为150±15微米，高度为250微米；相应地，在所述的纵行微通道(106)另一侧，前述缓冲通道(107)向靠近加样口一侧100微米处设置有另一侧缓冲通道(107)；所述所有纵行微通道(106)、缓冲通道(107)与微反应单元(108)体积...
【专利技术属性】
技术研发人员：梅浩坤，庄添驰，高畅，季明辉，孙舒婷，杨英淇，赵文武，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
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