【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及dna逻辑电路，特别涉及一种无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法及其应用。
技术介绍
1、脱氧核糖核酸(dna)是一种基于沃森-克里克(watson-crick)碱基配对的高度可编程的生物分子，其结构和组成特性，决定了它在生物转化过程中具有特异性的识别能力、强大的催化能力以及高度的灵敏性，已被开发用于各种目的，例如生物识别、分子信号传感、逻辑计算、电路和分子模拟等各个领域。其中，dna链置换技术是dna分子计算领域的重要技术基础，也是构建逻辑电路或生物传感器的重要组成部分。dna链置换技术的理论基础是dna分子单链间的碱基互补配对以及分子杂交系统的动力学自由能趋于稳定，链置换利用dna分子杂交的自由能差异，以一条单链(入侵链)触发双杂交dna(双链dna，dsdna)分子上的链迁移，将另一条单链置换出来用于后续反应，并以更稳定的结构(形成新的dna双链)结束。dna链置换具有以下几个优点：1)是自发性，整个反应过程在立足点(toehold)的诱导下即可发生，不需要其他生物酶的参与；2)灵敏性，链置换反应在室温下即可进行，反应时长30min左右基本达到稳定状态；3)准确性，dna分子间的碱基互补配对原则充分保证了这一点。然而，dsdna在生物系统中通常以钝端形式出现，即缺乏立足点，因此，这种惰性dsdna难以通过核酸的熵/焓变化被响应，导致它们无法通过链置换反应被利用，额外需要酶来启动后续反应。
2、迄今为止，钝端dsdna的可用响应物主要依赖于cas9核酸酶或其他具有特定序列限制的核酸内切酶。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法，并提供了该方法在dna逻辑电路和生物传感器构建中的应用中的应用。本专利技术具体通过以下技术方案实现：
2、本专利技术第一方面提供了一种无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法，包括以下步骤：采用惰性双链dna作为底物，加入链置换反应试剂和指数扩增反应试剂，形成混合反应溶液，在75-85℃下反应10-50min；所述混合反应溶液包括：底物、ttago蛋白、gdna、模板、vent聚合酶、mn2+、dntp和缓冲液，其中，所述底物由靶标链和非靶标链互补形成，所述gdna用于与所述靶标链互补以引导所述ttago蛋白切割所述靶标链产生引物，所述模板包括中间的gdna互补序列和两端的引物互补序列，所述引物用于与所述模板的5’端结合并通过所述vent聚合酶复制延伸。
3、本专利技术第二方面提供了如上所述的无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法在dna逻辑电路和生物传感器构建中的应用。
4、本专利技术第三方面提供了一种惰性双链dna输入的dna逻辑电路的构建方法，包括：信号输入，用于通过如上所述的无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法将输入的惰性双链dna底物转换为逻辑电路输入片段；逻辑转换，用于将输入片段经过链置换反应得到逻辑电路输出片段；信号输出，用于将输出片段与报告基因进行链置换反应，释放荧光信号并进行信号输出，其中，报告基因包括双链部分和5’黏末端部分，双链部分的末端分别独立地标记荧光基团和淬灭基团，所述输出片段与所述报告基因的5’黏末端互补。
5、可选地，所述逻辑电路包括and电路、or电路和/或xor电路；当所述逻辑电路为and电路时，所述输入片段包括输入片段a和输入片段b，将所述信号输入获得的包含所述输入片段a和所述输入片段b的溶液同时输入与门1和与门2中，所述与门1包括b*a*c*片段，所述与门2包括a*b*c*片段，依次经过聚合延伸和链置换反应，得到输出片段c；当所述逻辑电路为or电路时，所述输入片段包括输入片段a和输入片段b，将所述信号输入获得的包含所述输入片段a和所述输入片段b的溶液同时输入或门1和或门2中，所述或门1包括b*o*c*片段，所述或门2包括a*o*c*片段，经过链置换反应，得到输出片段c；当所述逻辑电路为xor电路时，所述输入片段包括输入片段a*b和输入片段b*a，将所述信号输入获得的包含所述输入片段a*b和所述输入片段b*a的溶液同时输入异或门1和异或门2中，所述异或门1包括b*o*c*片段，所述异或门2包括a*o*c*片段，经过链置换反应，得到输出片段c；其中，a*、b*和c*片段分别与输入片段a、输入片段b和输出片段c互补。
6、本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术通过添加ttago蛋白、gdna、模板、vent聚合酶与底物形成链置换的放大反应体系，其反应产生的引物与ttago蛋白、gdna、模板和vent聚合酶进一步形成等温指数扩增反应体系，通过前述两个反应的协同作用，对于任意含有序列xy的惰性dsdna底物，可实现高效转化为易反应的ssdna，且保证了即使在低浓度dsdna的情况下，也可以产生足够的ssdna输出用于后续应用，克服了序列位置或dna构象要求的限制，大大拓展了惰性dsdna的应用范围和领域。本专利技术成功实现了以任意序列输入的dsdna在逻辑电路和生物传感器中应用，实现了惰性dsdna更广泛的功能。
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1.一种无序列依赖性惰性双链DNA生成单链DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用惰性双链DNA作为底物，加入链置换反应试剂和指数扩增反应试剂，形成混合反应溶液，在75-85℃下反应10-50min；
2.根据权利要求1所述的无序列依赖性惰性双链DNA生成单链DNA的方法，其特征在于，所述底物的浓度为0.1nM-1μM，所述TtAgo蛋白的浓度为50nM-100nM，所述gDNA浓度为10nM-500nM，所述模板的浓度为300nM，所述Vent聚合酶的浓度为25U/mL，所述Mn2+的浓度为250μM，所述dNTP的浓度为250mM。
3.根据权利要求1所述的无序列依赖性惰性双链DNA生成单链DNA的方法，其特征在于，所述TtAgo蛋白和所述gDNA的摩尔比为1：1。
4.根据权利要求3所述的无序列依赖性惰性双链DNA生成单链DNA的方法，其特征在于，所述gDNA包括至少2个，每个所述gDNA与所述靶标链的不同区域互补。
5.根据权利要求1所述的无序列依赖性惰性双链DNA生成单链DNA的方法，其特征在于，在85℃反应10-50
6.如权利要求1-5任一项所述的无序列依赖性惰性双链DNA生成单链DNA的方法在DNA逻辑电路和生物传感器构建中的应用。
7.一种惰性双链DNA输入的DNA逻辑电路的构建方法，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的惰性双链DNA输入的DNA逻辑电路的构建方法，其特征在于，所述逻辑电路包括AND电路、OR电路和/或XOR电路；
9.根据权利要求8所述的惰性双链DNA输入的DNA逻辑电路的构建方法，其特征在于，所述AND电路中所述底物浓度为250nM，所述OR电路和所述XOR电路中所述底物浓度为50nM；
10.根据权利要求7所述的惰性双链DNA输入的DNA逻辑电路的构建方法，其特征在于，在85℃进行信号输入，在55℃进行信号输出。
...【技术特征摘要】
1.一种无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用惰性双链dna作为底物，加入链置换反应试剂和指数扩增反应试剂，形成混合反应溶液，在75-85℃下反应10-50min；
2.根据权利要求1所述的无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法，其特征在于，所述底物的浓度为0.1nm-1μm，所述ttago蛋白的浓度为50nm-100nm，所述gdna浓度为10nm-500nm，所述模板的浓度为300nm，所述vent聚合酶的浓度为25u/ml，所述mn2+的浓度为250μm，所述dntp的浓度为250mm。
3.根据权利要求1所述的无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法，其特征在于，所述ttago蛋白和所述gdna的摩尔比为1：1。
4.根据权利要求3所述的无序列依赖性惰性双链dna生成单链dna的方法，其特征在于，所述gdna包括至少2个，每个所述gdna与所述靶...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴曈勃，李小龙，胡明昊，谢天赐，朱梓轩，凌宸，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：
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