【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物模型领域，特别涉及uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法和应用。
技术介绍
1、随着人们生活方式和饮食结构的改变，高尿酸血症已成为仅次于糖尿病的第二大代谢性疾病，我国乃至全球总体患病率逐年升高，并呈年轻化趋势。除了痛风，血尿酸水平升高还与内分泌代谢、肾脏、心脑血管等多系统疾病的发生和发展有关，严重威胁人类生命健康和生活质量。人类之外的哺乳动物均具有尿酸氧化酶(urate oxidase，uox)，其血尿酸水平极低，因此建立稳定升高的高尿酸动物模型备具挑战。虽经数十年的努力研发，由于高尿酸血症的病因和发病机制纷繁复杂，全球范围内仍然缺乏高度模拟人类尿酸代谢的高尿酸血症实验动物模型，不能满足对发病机制和现代药物研发的研究需求。
2、目前报道的鼠类高尿酸血症模型大致分为环境诱导和基因修饰两大类。通过环境因素复制模型的原理包括：(1)增加尿酸产生的原料：饲料中添加高嘌呤、高果糖的食物或尿酸的前体物质；(2)抑制尿酸的排泄途径：用腺嘌呤、烟酸、乙胺丁醇等抑制肾脏对尿酸的排泄，进而增加血尿酸浓度，形成高尿酸血症；(3)抑制uox活性：氧嗪酸钾的结构和尿酸的嘌呤环相类似，其竞争性地与uox相结合，部分可抑制其活性，造成动物体内尿酸的升高。目前广泛使用的上述动物模型均存在一定的问题，不能满足时限较长的研究需要。首先，由于动物与人类之间的尿酸代谢差异，血尿酸水平仅增加1.5～2.1倍，难以达到与人类高尿酸血症类似的水平；其次，在选择饲喂方式给药时，造模质量受到动物个体差异和进食量的影响，较难控制组间差异；另
3、基因技术是通过对与人类高尿酸血症相关的小鼠同源基因进行基因修饰，产生长期稳定的自发性小鼠高尿酸血症模型。鉴于编码uox的基因在人类中失活，小鼠同源基因uox的基因修饰无疑是最重要的靶点，可以产生“类人”的高尿酸血症模型。研究人员曾利用两种uox敲除方法来构建高尿酸血症小鼠模型，如表1所示。
4、表1
5、
6、例如，1993年wu等人首次构建uox-/-模型，通过将新霉素选择盒插入到uox的外显子3中来介导uox基因的破坏，并移动开放阅读框的基因，将该盒插入129/svev小鼠的胚胎干细胞中，经同源重组和胚胎干细胞选择后注入c57bl/6j小鼠囊胚中生成嵌合体，uox-/-小鼠通过交配杂合子uox+/-小鼠产生具有杂交遗传背景的小鼠(c57bl/6j×129sv)，uox-/-小鼠的平均血清尿酸盐浓度为11.0±1.7mg/dl，是野生型的12倍，但杂合子交配的uox-/-小鼠出生率为7.1％，远低于预期的25％，表明uox-/-基因型与胚胎致死率有关。2018年我国科学家lu等人利用转录激活因子样效应核酸酶(talen)技术删除uox外显子3中含有28个碱基对的区域，在c57bl/6j背景下生成另一个uox敲除小鼠模型，这些uox-/-小鼠血清尿酸浓度中度升高，与人类高尿酸血症相似(雄性8.7±2.3mg/dl，雌性7.1±1.6mg/dl)，与杂合子交配的uox-/-小鼠出生率为15.9％，同样存在胚胎致死率的问题，该模型中小鼠出现肾功能障碍，男性uox-/-小鼠还出现代谢紊乱，胰岛素分泌减少，糖尿病易感性增加，而雌性小鼠则出现高血压，伴有脂代谢紊乱，可见胚胎致死性是研发uox敲基因小鼠模型的主要挑战之一。
7、为了产生与人类高尿酸血症相当的血尿酸水平的小鼠模型，敲除uox基因是必要的。目前通过uox基因干预方式建立的高尿酸血症小鼠模型并不多，且胚胎致死率较高。crispr/cas9技术作为目前全球最前沿的基因组靶向编辑技术，具有成本低廉，操作方便，效率高等优点，在哺乳动物的人类疾病模型的构建、基因工程、基因治疗等领域深受欢迎。目前鲜有利用crispr/cas9技术构建uox-/-小鼠模型等报道。
技术实现思路
1、为克服现有技术的上述不足，本专利技术的主要目的在于提供uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，利用crispr/cas9技术高效敲除uox基因，建立高度模拟人类尿酸代谢的科学、合理、高效且长期稳定的高尿酸血症小鼠模型。
2、本专利技术的另一目的在于提供uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型在高尿酸血症相关肾病、心血管疾病和糖代谢紊乱的发病机制研究、药物研发和/或药物筛选中的应用。
3、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、本专利技术提供uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，以c57bl/6背景小鼠为对象，包括以下步骤：
5、s1、通过crispr/cas9设计针对uox基因(ncbi gene id：22262)敲除的靶点grna；
6、s2、设计并合成grna引物，其序列如seq id no:3和seq id no:4所示；
7、s3、以puc57-t7-grna质粒为模板，使用所述grna引物进行pcr反应，电泳检测pcr产物，纯化，得到pcr纯化产物；
8、s4、所述pcr纯化产物体外转录，得到grna，序列如seq id no:1和seq id no:2所示；
9、s5、所述grna和cas9蛋白导入c57bl/6背景小鼠中；
10、s6、步骤s5中所述c57bl/6背景小鼠传代培养，得到稳定遗传的uox基因敲除c57bl/6小鼠。
11、作为优选，步骤s1中，所述靶点grna在位于所述c57bl/6背景小鼠uox基因序列的第2至第4号外显子exon 2-4，在intron 1-2和intron 4-5设计打靶得到，敲除区域为3.3kb。
12、作为优选，步骤s4中，所述grna包括grna1和grna2，序列分别如seq id no:1和seqid no:2所示：
13、grna1：gttaactccaaactatatag(seq id no:1)；
14、grna2：ggttactggatcattggtac(seq id no:2)。
15、作为优选，步骤s2中，所述grna引物分别为sgrna-universal-pcr-f和sgrna-universal-pcr-r，序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示；
16、sgrna-universal-pcr-f：tctcgcgcgtttcggtgatgacgg(seq id no:3)；
17、sgrna-universal-pcr-r：aaaaaaagcaccgactcggtgccactttttc(seq id no:4)。
18、作为优选，步骤s3中，所述puc57-t7-grna质粒包括puc57-t7-grna1质粒和puc57-t7-grna2质粒，序列分别如seq id no:5和s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述靶点gRNA位于所述C57BL/6背景小鼠UOX基因序列的第2至第4号外显子exon 2-4，在intron 1-2和intron 4-5设计打靶得到，敲除区域为3.3kb。
3.根据权利要求1所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述gRNA引物分别为SgRNA-universal-PCR-F和SgRNA-universal-PCR-R，序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述pUC57-T7-gRNA质粒包括pUC57-T7-gRNA1质粒和pUC57-T7-gRNA2质粒，序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
5.根据权利要求1所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸
6.根据权利要求1所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤S5中，所述gRNA和Cas9蛋白显微注射到C57BL/6背景小鼠的受精卵细胞中，其中gRNA的终浓度为400ng/μL，Cas9蛋白的终浓度为500ng/μL。
7.根据权利要求1所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤S6中，所述传代培养的方法包括：
8.根据权利要求7所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，所述UOX基因敲除检测采用的引物为F1和R1，序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；和/或所述F1胚胎基因型鉴定采用的引物为F2和R2，序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示。
9.根据权利要求7所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤A4中，所述UOX基因敲除的纯合子出生至4～5周为死亡高峰期，4～5周后仍存活的小鼠中位生存期为87天。
10.一种UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型在高尿酸血症相关肾脏、心血管疾病及糖代谢紊乱的发病机制研究、药物研发和/或药物筛选中的应用，其特征在于，所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型通过权利要求1至9任一项所述UOX基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法得到。
...【技术特征摘要】
1.uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤s1中，所述靶点grna位于所述c57bl/6背景小鼠uox基因序列的第2至第4号外显子exon 2-4，在intron 1-2和intron 4-5设计打靶得到，敲除区域为3.3kb。
3.根据权利要求1所述uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤s2中，所述grna引物分别为sgrna-universal-pcr-f和sgrna-universal-pcr-r，序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。
4.根据权利要求1所述uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤s3中，所述puc57-t7-grna质粒包括puc57-t7-grna1质粒和puc57-t7-grna2质粒，序列分别如seq id no:5和seq id no:6所示。
5.根据权利要求1所述uox基因敲除小鼠自发性高尿酸血症模型的构建方法，其特征在于，步骤s4中，所述grna包括grna1和grna2，序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。
6.根据权利要求1所述u...
【专利技术属性】
技术研发人员：沙来买提·沙力，戴宇翔，葛均波，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：
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