【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及工业微生物，特别涉及一种生产3-羟基丁酸的菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid，3-hb)是一种具有广泛应用潜力的重要化学品，能够参与可生物降解塑料的合成，作为生物降解塑料聚3-羟基丁酸(phb)的单体，通过微生物发酵或化学合成方法制备phb。phb具有良好的生物降解性和生物相容性，可用于包装材料、医疗器械、农业覆盖物等，还可以和其他生物聚合物共聚，以改善其物理性质，如聚(3-羟基丁酸酯-4-羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸酯-6-羟基己酸酯)等。
2、3-hb单体通过聚合形成phb后，可用于多方面应用，尤其是环保方面。随着环保要求提高，在包装领域生物可降解材料越来越受到关注，正在逐步取代传统不可降解塑料。聚羟基丁酸酯的物理性能，机械性能与聚丙烯类似，并且具有可生物降解性，在自然界中降解产物为二氧化碳和水，对环境无污染，故在包装领域有广泛应用前景。因此，研究开发利用高效生产3-hb的方法对于推动生物基化学品的发展，减少对有限资源的依赖以及减少环境影响具有重要意义。近年来，利用生物法合成3-hb的方法受到了广泛关注。但目前3-hb的生产面临一个主要问题：中间产物乙酸的产量较大，导致流向3-hb的量大大减少，从而降低了生产效率，成为制约3-hb生产的最大挑战。因此，亟需一种能够提高3-hb产量的方法，以提高工业生产的效率，降低生产成本。
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种生产3-
2、本专利技术提供了一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法，包括如下步骤：
3、s1：体外扩增phaa、phab、tesb基因的序列，将基因的序列连接成单一片段，将单一片段导入质粒；所述tesb的核苷酸序列如seq id no.63所示。
4、s2：将s1所述质粒导入菌株中。
5、进一步的，步骤s2所述菌株为escherichia coli nissle 1917、escherichiacoli jm109、halomonas sp.ly03、lactobacillus gasseri atcc 33323和bacilluscoagulans dsm1中的任意一种。
6、本申请中使用的halomonas sp.ly03菌株已于2023年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为gdmcc no：63382。菌株名称为halomonas sp.ly03，分类命名为halomonas sp.。
7、进一步的，步骤s1中所述phaa为物种来源为halomonas sp.td01的phaatd、物种来源为ralstonia eutropha的phaare中的任意一种；所述phaatd的核苷酸序列如seq idno.61所示，所述phaare核苷酸序列如seq id no.64所示；
8、进一步的，步骤s1中所述phab为物种来源为halomonas sp.td01的phabtd、物种来源为ralstonia eutropha的phabre中的任意一种。所述phabtd的核苷酸序列如seq idno.62所示，所述phabre的核苷酸序列如seq id no.65所示；
9、进一步的，步骤s1所述单一片段为tesb-phaatd-phabtd、tesb-phaare-phabtd、tesb-phaare-phabre、tesb-phabtd-phaatd、phaatd-tesb-phabtd、phabtd-tesb-phaatd、phaatd-phabtd-tesb、phabtd-phaatd-tesb中的任意一种，优选为phaatd-tesb-phabtd。
10、所述tesb-phaatd-phabtd的核苷酸序列如seq id no.53所示；所述tesb-phaare-phabtd的核苷酸序列如seq id no.54所示；所述tesb-phaare-phabre的核苷酸序列如seq idno.55所示；所述tesb-phabtd-phaatd的核苷酸序列如seq id no.56所示；所述phaatd-tesb-phabtd的核苷酸序列如seq id no.57所示；所述phabtd-tesb-phaatd的核苷酸序列如seq idno.58所示；所述phaatd-phabtd-tesb的核苷酸序列如seq id no.59所示；所述phabtd-phaatd-tesb的核苷酸序列如seq id no.60所示；
11、本专利技术还提供一种生产3-羟基丁酸的菌株，由所述的构建方法得到。
12、本专利技术还提供一种使用所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法，包括如下步骤：将菌株活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。
13、进一步的，所述发酵培养基中包括短链脂肪酸，优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。
14、进一步的，所述短链脂肪酸的添加量为3～12g/l。
15、进一步的，所述发酵的温度为36～42℃，ph为6～11，发酵的时间为12～48h。
16、综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
17、(1)本专利技术构建的联合代谢途径菌株，提高了3-hb的产量。
18、(2)本专利技术对联合代谢途径进一步优化、发酵中添加乙酸钠底物，减少了中间代谢产物乙酸对细菌3-hb产量的影响，进一步提高了3-hb的产量。
19、(3)本专利技术利用工程菌发酵生产3-hb，生产工艺简单、生产效率高，适用于工业化连续性生产。
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1.一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2所述菌株为Escherichia coliNissle 1917、Escherichia coli JM109、Halomonas sp.LY03、Lactobacillus gasseriATCC 33323和Bacillus coagulans DSM1中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述phaA为物种来源为Halomonas sp.TD01的phaATD、物种来源为Ralstonia eutropha的phaARE中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述phaB为物种来源为Halomonas sp.TD01的phaBTD、物种来源为Ralstonia eutropha的phaBRE中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1所述单一片段为tesB-phaATD-phaBTD、tesB-phaARE-pha
6.一种生产3-羟基丁酸的菌株，其特征在于，由权利要求1～5任一项所述的构建方法得到。
7.一种使用权利要求6所述的菌株生产3-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将菌株活化，进行摇瓶种子培养后在发酵培养基中进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中包括短链脂肪酸，优选为乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述短链脂肪酸的添加量为3～12g/L。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为36～42℃，发酵的pH为6～11，发酵的时间为12～48h。
...【技术特征摘要】
1.一种生产3-羟基丁酸的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s2所述菌株为escherichia colinissle 1917、escherichia coli jm109、halomonas sp.ly03、lactobacillus gasseriatcc 33323和bacillus coagulans dsm1中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中所述phaa为物种来源为halomonas sp.td01的phaatd、物种来源为ralstonia eutropha的phaare中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1中所述phab为物种来源为halomonas sp.td01的phabtd、物种来源为ralstonia eutropha的phabre中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤s1所述单一片段为tesb...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶健文，杨富荏，林艺娜，王俊，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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