【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片及其使用方法，属于微流控芯片。
技术介绍
1、数字pcr（dpcr）是一种新兴的核酸检测技术,继承了 pcr 和荧光定量 pcr（qpcr）的优点,并开创了新的发展方向。dpcr 最独特之处在于,它可以在无需标准曲线的情况下,对核酸样本实现绝对定量分析，尤其适用于微量dna检测与定量，从而实现高灵敏度检测。
2、尽管 dpcr 是基于微管或者微孔板开发的, 但随着微流体技术的成熟,dpcr 技术也有了很大提升。目前,根据稀释方法的不同，dpcr 平台主要分为两类，分别是微滴数字pcr（ddpcr）和微阵列芯片式数字 pcr（cdpcr）。ddpcr 是利用两种不互溶的流体，分别作为连续相（油）和分散相（水）反应，在两种流体的表面张力及剪切力的联合作用下，使分散相变成 μl 级的微小体积存在于连续相内，形成“油包水”的液滴 。cdpcr 则是通过设计芯片，在芯片上分割有上万个相同体积的微孔方阵，在试验时可以将 μl 的液体封闭在高通量的微池中,再在独立的微反应单元中进行后续的 pcr 扩增。
3、将数字pcr与微流控技术相结合的微滴式数字pcr技术，是近年来迅速发展起来的一种突破性的检测和定量核酸的技术。其中，液滴微流控技术是在微尺度下利用连续相的流体剪切力来破坏离散相的表面张力，将离散相分割成纳升级甚至皮升级液滴。基于流体剪切力生成液滴的方法包括t型通道法和流动聚焦法等。但上述方法中液滴尺寸和液滴生成过程高度依赖于毛细管数、两相流速、粘度比和通
4、离心式微流控芯片又称微流控芯片实验室或者芯片实验室，作为众多微流控驱动手段之一，是一种以在微米尺度的空间中对流体进行操控为主要特色的技术。通过设计微流控通道、混合反应器，将各部件微型化，并引入离心力的驱动方式，解决了经典微流控芯片在阀控、流体分裂、分离、液滴形成和孵育中存在的泵和混合问题。
5、目前，临床上对于高通量样本检测具有较广泛的需求，在感染性疾病的快速准确诊断方面，传统的微生物培养技术通常耗时较长，且往往需要昂贵的设备和专业的技术人员，对检测环境要求高，而高通量分型检测技术可以快速、准确地检测出病原体，在短时间内提供更准确的结果，有助于医生及时制定治疗方案，这对于感染性疾病的早期诊断和治疗至关重要。
6、同时，在病原体耐药性的监测方面，高通量分型检测技术可以检测病原体的基因序列，从而确定其对药物的耐药性。这对于指导临床合理用药、避免无效治疗和耐药性的传播具有重要意义，还可以为研究病原体的进化、传播和流行趋势等提供思路。
7、总之，临床对于高通量病原体以及病毒、细菌耐药性的检测需求广泛，涉及到感染性疾病的诊断、治疗、预防和控制等多个方面。随着技术的不断发展和应用，高通量测序技术在临床上的应用将会越来越广泛。然而，目前用于微滴生成制备的离心式微流控芯片仅能实现样本与引物单一结合的功能，并不具备分区分型检测能力，难以满足当前临床上广泛存在的对多种病原体、不同种类细菌与病毒的耐药性基因高通量同时快速分检的需求。
技术实现思路
1、为满足当前临床上广泛存在的对多种病原体、不同种类细菌与病毒的耐药基因同时快速分检的需求，本专利技术提供一种用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片及其使用方法，以解决现有技术的微流控芯片不能实现分区分型检测的技术问题。
2、本专利技术采用如下技术方案：一种用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片，其包括圆形的芯片本体，芯片本体内开设有有中轴安装孔，芯片本体上分为两个以上的扇形区域，每个扇形区域上从中心到外缘依次设置有缓液池、储液池和微滴生成单元，缓液池的进口处设有加样孔，所述储液池采用弧形槽结构，弧形槽分布在中轴安装孔的外周且圆心朝向芯片本体的中心，储液池的进液口位于弧形槽的一端，所述缓液池的出口和储液池的进液口通过进液管道连通，储液池上设有朝向芯片本体外缘的出液口，出液口至少有两个且在弧形槽上间隔分布，每个出液口上分别连接有微滴生成单元，每个微滴生成单元包括由芯片本体中心到外缘依次连通的第一微流控通道、引物室、第二微流控通道和微滴生成池，第一微流控通道与储液池的出液口连接，且第一微流控通道的宽度小于储液池出液口的宽度，第二微流控通道的最大宽度小于第一微流控通道的宽度，所述引物室用于存放不同引物的冻干微球，所述微滴生成池的侧面设有与微滴生成池连通的油相收集池，初始时微滴生成池装满油相，油相收集池用于收集微滴生成池生成微滴后溢出的油相。
3、所述芯片本体上位于中轴安装孔的外周设有均匀分布的固定卡槽，固定卡槽位于缓液池和储液池之间。
4、所述芯片本体上的扇形区域为四个，每个扇形区域上的微滴生成单元的数量均在4~8之间；每个储液池上的出液口的数量与每个扇形区域上的微滴生成单元的数量相等，每个微滴生成单元分别与每个出液口连通。
5、所述进液管道包括两段，进液管道的第一段与缓液池的出口连接且朝向芯片本体中心延伸，然后与进液管道的第二段连接，进液管道的第二段由芯片本体中心向外缘延伸后与储液池的进液口连接。
6、所述弧形槽远离进液管道的一端连接有径向槽，径向槽的一端与弧形槽的端部连接、另一端朝向芯片本体外缘延伸；所述弧形槽由进液管道处向径向槽处宽度逐渐增大。
7、所述第一微流控通道采用十字形结构，十字形的上下两端分别连接在储液池的出液口和微滴生成池上。
8、所述第二微流控通道包括与引物室的出口连接的总管，总管上连接有支管，所述支管的数量为两级以上，沿液体流动方向，各级支管的数量逐级增多，最后一级支管与引物室的进口连接，各级支管连接在一起形成树形结构。
9、各级支管中，沿液体流动方向，支管的宽度逐级减小。
10、所述第一微流控通道的宽度为60~120μm；所述第二微流控通道的宽度为20~60μm。
11、用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片的检测方法，其是上述用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片进行：将芯片本体安装在转轴上，微滴生成池装满油相，引物室内装有引物冻干微球，向加样孔中加入样本，利用转轴带动芯片本体转动，样本在离心力的作用下由缓液池依次进入储液池和微滴生成单元，改变转轴的转速来调控离心力，利用芯片本体转动时的离心力驱动样本流动，来实现样本分布到不同的微滴生成单元中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：其包括圆形的芯片本体，芯片本体内开设有有中轴安装孔，芯片本体上分为两个以上的扇形区域，每个扇形区域上从中心到外缘依次设置有缓液池、储液池和微滴生成单元，缓液池的进口处设有加样孔，所述储液池采用弧形槽结构，弧形槽分布在中轴安装孔的外周且圆心朝向芯片本体的中心，储液池的进液口位于弧形槽的一端，所述缓液池的出口和储液池的进液口通过进液管道连通，储液池上设有朝向芯片本体外缘的出液口，出液口至少有两个且在弧形槽上间隔分布，每个出液口上分别连接有微滴生成单元，每个微滴生成单元包括由芯片本体中心到外缘依次连通的第一微流控通道、引物室、第二微流控通道和微滴生成池，第一微流控通道与储液池的出液口连接，且第一微流控通道的宽度小于储液池出液口的宽度，第二微流控通道的最大宽度小于第一微流控通道的宽度，所述引物室用于存放不同引物的冻干微球，所述微滴生成池的侧面设有与微滴生成池连通的油相收集池，初始时微滴生成池装满油相，油相收集池用于收集微滴生成池生成微滴后溢出的油相。
2.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字P
3.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述芯片本体上的扇形区域为四个，每个扇形区域上的微滴生成单元的数量均在4~8之间；每个储液池上的出液口的数量与每个扇形区域上的微滴生成单元的数量相等，每个微滴生成单元分别与每个出液口连通。
4.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述进液管道包括两段，进液管道的第一段与缓液池的出口连接且朝向芯片本体中心延伸，然后与进液管道的第二段连接，进液管道的第二段由芯片本体中心向外缘延伸后与储液池的进液口连接。
5.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述弧形槽远离进液管道的一端连接有径向槽，径向槽的一端与弧形槽的端部连接、另一端朝向芯片本体外缘延伸；所述弧形槽由进液管道处向径向槽处宽度逐渐增大。
6.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述第一微流控通道采用十字形结构，十字形的上下两端分别连接在储液池的出液口和微滴生成池上。
7.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述第二微流控通道包括与引物室的出口连接的总管，总管上连接有支管，所述支管的数量为两级以上，沿液体流动方向，各级支管的数量逐级增多，最后一级支管与引物室的进口连接，各级支管连接在一起形成树形结构。
8.根据权利要求7所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：各级支管中，沿液体流动方向，支管的宽度逐级减小。
9.根据权利要求7所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片，其特征在于：所述第一微流控通道的宽度为60~120μm；所述第二微流控通道的宽度为20~60μm。
10.用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片的使用方法，其是采用权利要求1-10中任意一项的用于样本高通量分型检测的离心式数字PCR芯片进行，其特征在于：将芯片本体安装在转轴上，微滴生成池装满油相，引物室内装有引物冻干微球，向加样孔中加入样本，利用转轴带动芯片本体转动，样本在离心力的作用下由缓液池依次进入储液池和微滴生成单元，改变转轴的转速来调控离心力，利用芯片本体转动时的离心力驱动样本流动，来实现样本分布到不同的微滴生成单元中，依次实现其与不同引物室中引物的结合以及与微滴生成池中油相的混合；调整转速为1500rad时，样本受离心力作用进入储液池；调整转速为2000rad时，样本通过第一微流控通道进入不同分区的引物室与引物充分混合；调整转速为2500rad时，样本引物结合物通过第二微流控通道进入微滴生成池，形成“油包水”的样本-引物结合微滴。
...【技术特征摘要】
1.一种用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片，其特征在于：其包括圆形的芯片本体，芯片本体内开设有有中轴安装孔，芯片本体上分为两个以上的扇形区域，每个扇形区域上从中心到外缘依次设置有缓液池、储液池和微滴生成单元，缓液池的进口处设有加样孔，所述储液池采用弧形槽结构，弧形槽分布在中轴安装孔的外周且圆心朝向芯片本体的中心，储液池的进液口位于弧形槽的一端，所述缓液池的出口和储液池的进液口通过进液管道连通，储液池上设有朝向芯片本体外缘的出液口，出液口至少有两个且在弧形槽上间隔分布，每个出液口上分别连接有微滴生成单元，每个微滴生成单元包括由芯片本体中心到外缘依次连通的第一微流控通道、引物室、第二微流控通道和微滴生成池，第一微流控通道与储液池的出液口连接，且第一微流控通道的宽度小于储液池出液口的宽度，第二微流控通道的最大宽度小于第一微流控通道的宽度，所述引物室用于存放不同引物的冻干微球，所述微滴生成池的侧面设有与微滴生成池连通的油相收集池，初始时微滴生成池装满油相，油相收集池用于收集微滴生成池生成微滴后溢出的油相。
2.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片，其特征在于：所述芯片本体上位于中轴安装孔的外周设有均匀分布的固定卡槽，固定卡槽位于缓液池和储液池之间。
3.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片，其特征在于：所述芯片本体上的扇形区域为四个，每个扇形区域上的微滴生成单元的数量均在4~8之间；每个储液池上的出液口的数量与每个扇形区域上的微滴生成单元的数量相等，每个微滴生成单元分别与每个出液口连通。
4.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片，其特征在于：所述进液管道包括两段，进液管道的第一段与缓液池的出口连接且朝向芯片本体中心延伸，然后与进液管道的第二段连接，进液管道的第二段由芯片本体中心向外缘延伸后与储液池的进液口连接。
5.根据权利要求1所述的用于样本高通量分型检测的离心式数字pcr芯片...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨英淇，庄添驰，喻悦，高畅，季明辉，徐婷，梅浩坤，储金雨，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
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