【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，具体涉及一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法及其在检测新冠病毒中的应用。
技术介绍
1、近年来从原核生物适应性免疫机制衍生出的crispr/cas系统，以其开发性强、简单高效等特点，既为体内基因编辑技术带来革命性突破，也在体外诊断领域大放异彩。crispr相关蛋白cas9和cas12a是其中最具影响力和应用最广泛的两个成员，它们可以结合基因组中原间隔邻近基序protospacer-adjacent motif(pam)导致双链dna double-stranded dna(dsdna)靶点的局部开放，使得向导rna(guide rna)与dsdna靶标的模板链之间形成watson-crick碱基配对，最终形成r-loop结构，引发cas核酸酶结构域的结构重排激活其顺式切割活性导致双链dna断裂达到基因编辑的目的。
2、与cas9不同的是，cas12a只需要单个crispr rna(crrna)作为grna靶向；且可以识别切割无需pam基序的单链dna(ssdna)靶标。此外，crispr/cas12a系统在装载靶标后可以激活其反式切割(trans cleavage)活性，非特异性切割附近单链dna(ssdna)分子。基于这种特性，引入荧光报告基团和淬灭基团的ssdna作为报告探针分子，当靶标dna与crrna形成r-loop结构激活cas12a后，切割报告探针分子，释放荧光信号，从而使其应用于核酸检测和生物传感领域。而为了实现高灵敏度的分子检测，通常需要将靶核酸预扩增
3、众所周知，单核苷酸变异(single-nucleotide variation，snv)的检测对于遗传疾病、癌症以及病原体变异株的诊断具有重要的意义。然而cas12a的特异性一直备受争议，虽然有报道指出cas12a在体内和体外的顺式切割活性特异性高于cas9，尤其是在pam-proximal区域。但仍有大量证据表明cas12a顺式切割活性不仅具备对单一错配的高度容忍性，甚至可以容忍多个错配。而cas12a的反式切割活性特异性也较差，无法区分单碱基变异。总体而言，cas12a的特异性不尽如人意，野生型和单碱基突变型之间的信噪比(signal-to-noise ratio)很低甚至没有，并不能满足snv诊断的要求，是其推广应用的瓶颈。
4、crispr/cas12a系统提升特异性的方式主要是通过改造cas12a酶或者crrna序列。相较于cas酶改造和筛选的繁琐，对其crrna序列进行改造是一种更为简便的策略。目前主要通过以下几种方式改造：①对crrna部分序列进行化学性修饰；②截短crrna的长度；③改变crrna的二级结构；④crrna部分序列替换成dna碱基；⑤crrna引入额外的错配碱基；⑥在crrna与靶点配对区域插入或删除碱基形成dna-rna空泡结构。
5、尽管已有数种通过改造crrna提升特异性的方式，但目前仍存在一些不足。①特异性提升不显著，某些靶点突变型与野生型的信噪比不足5倍。②灵敏度和特异性存在(trade-off)，比如化学修饰的grna虽然提升了特异性，但对某些靶点其顺式切割的活性有一定的衰减。③普适性受限，不同靶点其crrna需要化学修饰的位置不一；不同靶点最适引入额外的错配碱基的位置不一。因此，crispr/cas12a snv检测技术亟需大幅提升其特异性，同时保持其灵敏度，并拓展其通用性。
技术实现思路
1、一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法，采用如下技术方案：
2、一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法，该方法中对crrna进行了改造，改造方法为：将crrna中的spacer序列部分进行截短，并在截短后spacer序列中的特定部位引入摆动碱基错配。
3、为了提升cas12a反式切割特异性且有效保持其灵敏度，本专利技术对crrna进行了改造，首先进行spacer截短，截短后可在不影响灵敏度的条件下提高特异性，但这种特异性提升对于不同靶点和不同位置的效应不一致。因而为了进一步提高特异性和普适性，在截短后spacer中的特定部位引入摆动碱基配错配，会形成'double mismatch versus singlemismatch strategy'，使得靶点的单碱基错配容忍度下降，靶点单碱基突变的检测信号会进一步降低，导致靶点上每个位置的特异性都进一步提升。
4、优选的，所述spacer序列部分进行截短是在spacer序列的3’端截短2～4bp；在截短后spacer序列中的第14位引入摆动碱基错配。
5、进一步优选的，spacer序列部分进行截短是在spacer序列的3’端截短3bp。
6、优选的，所述的crrna进行了改造具体步骤为：靶点非模板链突变位置的最近距离找到a或c碱基，在突变位置的+2bp或者-2bp之内，定义为相对于pam的第14位，将crrnaspacer的长度缩短成17bp，然后将spacer上的14位碱基改成u或者g，在spacer-ts dna异源双链中的14位引入摆动碱基错配。
7、优选的，一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法，该方法中在rpa上游引物中引入cas12a的pam序列tttv,v＝a/c/g。
8、由于cas12a对于双链靶标序列的识别具有pam依赖性，且crrna的改造方法中引入摆动碱基配对对pam的距离具有限制，容易导致可检测序列范围缩小，本专利技术中在rpa上游引物中引入cas12a的pam序列tttv，可以摆脱对pam的距离的限制，保证可检测序列范围。
9、进一步优选的，所述的rpa上游引物的3'末端的4-14位置引入cas12a的pam序列tttv。
10、优选的，一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法，该方法中会在检测系统加入甘油。
11、在本专利技术检测系统中添加甘油可以减缓rpa与crispr系统的融合，也避免气溶胶污染，从而实现一管化检测。
12、所述的一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法在新冠病毒检测中的应用。
13、一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法在以ba5.2新冠病毒t1050n为靶点的检测中的应用，包括以下步骤：
14、s1:根据病毒t1050n靶点序列，设计crrna，crrna如序列表中seq id no.1所示，具体如下：5’-uaauuucuacuaaguguagau本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提升CRISPR/Cas12a SNV检测系统特异性的方法，其特征在于，该方法中对crRNA进行了改造，改造方法为：将crRNA中的Spacer序列部分进行截短，并在截短后Spacer序列中的特定部位引入摆动碱基错配。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Spacer序列部分进行截短是在Spacer序列的3’端截短2～4bp；在截短后Spacer序列中的第14位引入摆动碱基错配。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Spacer序列部分进行截短是在Spacer序列的3’端截短3bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的crRNA进行了改造具体步骤为：靶点非模板链突变位置的最近距离找到A或C碱基，在突变位置的+2bp或者-2bp之内，定义为相对于PAM的第14位，将crRNA spacer的长度缩短成17bp，然后将spacer上的14位碱基改成U或者G，在spacer-TSDNA异源双链中的14位引入摆动碱基错配。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，一种提升CRISPR/Cas12a S
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的RPA上游引物的3'末端的4-14位置引入Cas12a的PAM序列TTTV。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，一种提升CRISPR/Cas12a SNV检测系统特异性的方法，该方法中会在检测系统加入甘油。
8.一种根据权利要求1～7任意一项所述的提升CRISPR/Cas12a SNV检测系统特异性的方法在新冠病毒检测中的应用。
9.一种根据权利要求8所述的提升CRISPR/Cas12a SNV检测系统特异性的方法在以BA5.2新冠病毒T1050N为靶点的检测中的应用，包括以下步骤：
10.一种根据权利要求8所述的提升CRISPR/Cas12a SNV检测系统特异性的方法在以XBB新冠病毒Q183E为靶点的检测中的应用，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种提升crispr/cas12a snv检测系统特异性的方法，其特征在于，该方法中对crrna进行了改造，改造方法为：将crrna中的spacer序列部分进行截短，并在截短后spacer序列中的特定部位引入摆动碱基错配。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述spacer序列部分进行截短是在spacer序列的3’端截短2～4bp；在截短后spacer序列中的第14位引入摆动碱基错配。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，spacer序列部分进行截短是在spacer序列的3’端截短3bp。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的crrna进行了改造具体步骤为：靶点非模板链突变位置的最近距离找到a或c碱基，在突变位置的+2bp或者-2bp之内，定义为相对于pam的第14位，将crrna spacer的长度缩短成17bp，然后将spacer上的14位碱基改成u或者g，在spacer-tsdna异源双链中的14位引入摆动碱基错配。
5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛旭建，王凤鸣，许健，蒋靖怡，江锦宜，李琼，姚萍，
申请(专利权)人：常州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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