【技术实现步骤摘要】
本申请属于细胞免疫治疗，具体涉及靶向cll1的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
1、急性髓性白血病(aml)是成人患者中最常见和最致命的血液恶性肿瘤，aml目前的治疗手段仍以化疗和造血干细胞移植为主。随着移植技术的完善和传统化疗方案的优化，缓解率有了很大提高，但是仍有部分复发难治性患者因为存在肿瘤耐药等原因无法获得缓解。car-t细胞疗法是近年来极具前景的肿瘤免疫细胞治疗方法，通过基因工程的方法将一种或多种特异性嵌合抗原受体(car)表达于t细胞使其可靶向作用于肿瘤细胞。目前已经开发cd33、cd123、cll1、cd47、cd70和tim3等靶点用于aml免疫治疗。近几年越来越多的证据表明人c型凝集素样分子1(cll1，也称为clec12a，micl，dcal-2或cd371，属于c型凝集素样受体家族)是比较理想的一个靶点，cll1在绝大部分的新发或复发aml病例中过表达，重要的是cll1在白血病干细胞(lsc)上表达，但是在造血干细胞(hsc)中不表达。
2、目前针对cll1的在研疗法以car-t为主，已经有多个相关产品获批临床，靶向cll1的治疗不影响正常造血和淋巴细胞定向免疫功能，但会杀伤正常髓系细胞，导致粒细胞缺乏、血小板下降等。2022年7月，南开大学附属第一中心医院的研究人员在“journal ofhematology&oncology”上发表了cll1 car-t成人患者的i期试验结果。该研究进一步证明了cll1在aml中的治疗潜力，7/10(70％)的患者达到cr/cri(cr:完全缓解,c
3、目前在研的第二代cll1 car结构一般由cll1 scfv、cd8a铰链区和跨膜区、4-1bb/cd28共刺激信号、cd3ζ链胞内信号结构域组成。尽管car-t细胞治疗在血液瘤中取得了巨大的进步，但是aml的car-t治疗仍旧进展缓慢，car-t细胞在体内扩增受限、有限的杀伤能力以及t细胞耗竭难以在体内维持，同时髓系功能受损缺乏相应的替代治疗。这就需要cll1car-t迭代升级，以进一步提高安全性、耐受性和治疗效果。
4、程序性死亡受体1(pd-1)及其配体pd-l1信号通路在削弱抗肿瘤免疫应答方面发挥重要作用。
技术实现思路
1、本申请所要解决的技术问题是如何提高car-t细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
2、为解决上述技术问题，本申请提供car-t细胞，所述car-t细胞含有嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括单域抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞内信号区包括共刺激结构域4-1bb、激活结构域cd3ζ，所述胞内信号区还包括pd1蛋白胞外结构域(pfc)。
3、进一步地，所述的car-t细胞中，所述pd1蛋白胞外结构域(pfc)的氨基酸序列为seq id no.1的第398-794位。
4、进一步地，所述的car-t细胞中，所述单域抗体为针对cll1的抗体。
5、进一步地，所述的car-t细胞中，所述单域抗体的氨基酸序列为seq id no.1的第22-150位，所述铰链区为氨基酸序列是seq id no.1的第151-195位的cd8a铰链区，所述跨膜区为氨基酸序列是seq id no.1的第196-219位的cd8a跨膜区，所述共刺激结构域4-1bb的氨基酸序列为seq id no.1的第220-266位；所述激活结构域cd3ζ的氨基酸序列为seq idno.1的第267-378位。
6、进一步地，所述的car-t细胞中，所述嵌合抗原受体包括下述任一种：
7、a1)氨基酸序列是seq id no.1的第22-794位所示的蛋白质；
8、a2)将seq id no.1的第22-794位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
9、a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的与a1)具有相同功能的融合蛋白质。
10、a3)所述连接可通过肽键链接。
11、进一步地，所述的car-t细胞中，a3)中所述信号肽的氨基酸序列可为seq id no.1的第1-21位。
12、本文所述标签包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
13、术语“单域抗体”即重链单域抗体vhh(variabledomain of heavy chain ofheavy-chain antibody)为由抗体重链可变区组成的多肽。
14、本申请中，所述car-t细胞可为表达car的t细胞或car修饰的t细胞。
15、具体地，本申请中所述car-t细胞可为靶向cll1的car-t细胞，所述car-t细胞表达上述嵌合抗原受体。
16、本申请还提供上述的嵌合抗原受体。
17、所述嵌合抗原受体自n-末端至c-末端依次可包含所述信号肽、所述单域抗体、所述铰链区、所述跨膜区、所述共刺激结构域、所述激活结构域和pd1蛋白胞外结构域(pfc)。
18、在本申请的一个实施例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列是seq id no.1，seqid no.1的第1-21位为信号肽(signal)的氨基酸序列；seq id no.1的第22-150位为单域抗体(cll1-vhh)的氨基酸序列；seq id no.1的第151-195位为cd8a铰链区(hinge)的氨基酸序列；seq id no.1的第196-219位为cd8a跨膜区(tm)的氨基酸序列；seq id no.1的第220-266位为共刺激结构域4-1bb的氨基酸序列；seq id no.1的第267-378位为激活结构域cd3ζ的氨基酸序列，seq id no.1的第379-397位为p2a的氨基酸序列，seq id no.1的第398-794位为pfc的氨基酸序列。
19、本申请还提供与上述嵌合抗原受体相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：
20、b1)编码上述嵌合抗原受体的核酸分子；
21、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
22、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
23、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.CAR-T细胞，所述CAR-T细胞含有嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括单域抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞内信号区包括共刺激结构域4-1BB、激活结构域CD3ζ，其特征在于，所述胞内信号区还包括PD1蛋白胞外结构域。
2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述PD1蛋白胞外结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第398-794位。
3.根据权利要求1或2所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述单域抗体为针对CLL1的抗体。
4.根据权利要求3所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQID No.1的第22-150位，所述铰链区为氨基酸序列是SEQ ID No.1的第151-195位的CD8a铰链区，所述跨膜区为氨基酸序列是SEQ ID No.1的第196-219位的CD8a跨膜区，所述共刺激结构域4-1BB的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第220-266位；所述激活结构域CD3ζ的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第267-378位。
5.根据权利要求3或4所述的CAR
6.权利要求1-5中任一所述的嵌合抗原受体。
7.与权利要求6所述嵌合抗原受体相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
8.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-5中任一所述的CAR-T细胞。
9.权利要求1-5中任一所述的CAR-T细胞，或权利要求6所述的嵌合抗原受体，或权利要求7所述的生物材料，或权利要求8所述的药物组合物在下述任一项中的应用：
10.制备权利要求1-5中任一所述CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求7中所述的核酸分子转入T细胞中稳定表达，得到所述CAR-T细胞。
...【技术特征摘要】
1.car-t细胞，所述car-t细胞含有嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括单域抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞内信号区包括共刺激结构域4-1bb、激活结构域cd3ζ，其特征在于，所述胞内信号区还包括pd1蛋白胞外结构域。
2.根据权利要求1所述的car-t细胞，其特征在于，所述pd1蛋白胞外结构域的氨基酸序列为seq id no.1的第398-794位。
3.根据权利要求1或2所述的car-t细胞，其特征在于，所述单域抗体为针对cll1的抗体。
4.根据权利要求3所述的car-t细胞，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列为seqid no.1的第22-150位，所述铰链区为氨基酸序列是seq id no.1的第151-195位的cd8a铰链区，所述跨膜区为氨基酸序列是seq id no.1的第196-219位的cd8a跨膜区，所述共刺激结构域4-1bb的氨基酸序列为s...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱建高，杨文君，杨鑫，俞建东，
申请(专利权)人：浙江康佰裕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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