【技术实现步骤摘要】
本申请属于细胞免疫治疗，具体涉及一种靶向cll1的单域抗体、car-t细胞及其应用。
技术介绍
1、急性髓性白血病(aml)是成人患者中最常见和最致命的血液恶性肿瘤，aml目前的治疗手段仍以化疗和造血干细胞移植为主。随着移植技术的完善和传统化疗方案的优化，缓解率有了很大提高，但是仍有部分复发难治性患者因为存在肿瘤耐药等原因无法获得缓解。car-t细胞疗法是近年来极具前景的肿瘤免疫细胞治疗方法，通过基因工程的方法将一种或多种特异性嵌合抗原受体(car)表达于t细胞使其可靶向作用于肿瘤细胞。目前已经开发cd33、cd123、cll1、cd47、cd70和tim3等靶点用于aml免疫治疗。近几年越来越多的证据表明人c型凝集素样分子1(cll1，也称为clec12a，micl，dcal-2或cd371，属于c型凝集素样受体家族)是比较理想的一个靶点，cll1在绝大部分的新发或复发aml病例中过表达，重要的是cll1在白血病干细胞(lsc)上表达，但是在造血干细胞(hsc)中不表达。
2、目前在研的第二代cll1 car结构一般由cll1 scfv、cd8a铰链区和跨膜区、4-1bb/cd28共刺激信号、cd3ζ链胞内信号结构域组成。总的来说，靶向cll1的car-t细胞在aml患者中具有良好的耐受性和治疗效果，可以为患者提供移植前达到cr/cri的机会，从而降低复发风险和延长生存。，但是aml的car-t治疗仍旧进展缓慢，car-t细胞在体内扩增受限、有限的杀伤能力以及t细胞耗竭难以在体内维持，同时髓系功能受损缺乏相应的替代
3、pd-1(programmedcell death protein 1)是一种重要的免疫抑制分子，属于cd28超家族成员，是由268个氨基酸组成的i型跨膜蛋白。其配体pd-l1通常在肿瘤细胞表面表达。当肿瘤细胞细胞膜上的pd-l1与t细胞表面的pd-1分子结合后，能抑制t细胞增殖及细胞因子的产生，同事启动t细胞的“自毁”程序，进而产生免疫逃逸作用。因此，临床上使用抗pd-l1或者抗pd-1的抗体来阻断这种免疫逃逸作用的产生。
4、nkg2d配体(nkg2d ligands，nkg2dl)在广泛的血液恶性肿瘤中过表达。当细胞发生应激，例如在感染或恶性转化，nk细胞就能通过nkg2d-nkg2dls形式结合并杀伤肿瘤细胞。靶向nkg2d配体的car-t疗法已经在临床前和临床试验中展现出了优越的抗肿瘤效果和良好的安全性
技术实现思路
1、本申请所要解决的技术问题是如何提高靶向cll1的car-t细胞的肿瘤细胞杀伤能力。
2、为解决上述技术问题，本申请提供抗cll1的单域抗体，所述单域抗体包含氨基酸序列是seq id no.1第118-130位的hcdr3、氨基酸序列是seq id no.1第72-79位的hcdr2和/或氨基酸序列是seq id no.1第47-54位的hcdr1，所述hcdr3、hcdr2和hcdr1为3个互补决定区(cdr)。
3、进一步地，所述单域抗体的氨基酸序列为seq id no.1的第22-141位。
4、术语“单域抗体”即重链单域抗体vhh(variabledomain of heavy chain ofheavy-chain antibody)为由抗体重链可变区组成的多肽。vhh包含cdr1、cdr2和cdr3这三个互补决定区(cdrs)以及fr1、fr2、fr3和fr4这4个框架区(frs)。vhh可按照如下方法制备：将vhh基因通过基因工程方法表达。
5、本申请中，hcdr1、hcdr2和hcdr3为重链可变区中的三个互补决定区(cdr)。本申请中，所述互补决定区的序列可根据kabat或chothia或imgt编号系统定义。
6、在本申请的一些实施例中，所述互补决定区的序列可根据imgt编号系统定义。
7、本申请还提供嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外区、跨膜区和胞内信号区，所述嵌合抗原受体的胞外区含有上述的单域抗体。
8、进一步地，所述嵌合抗原受体的胞外区还包括铰链区，所述铰链区可为氨基酸序列是seq id no.1的第142-186位的cd8a铰链区。
9、进一步地，所述的嵌合抗原受体中，所述胞内信号区包括共刺激结构域4-1bb和融合蛋白，所述融合蛋白包括nkg2d胞外结构域和pd1胞外结构域。
10、进一步地，所述的嵌合抗原受体中，所述nkg2d胞外结构域的氨基酸序列为seq idno.1的第389-782位，所述pd1胞外结构域的氨基酸序列为seq id no.1的第805-1201位。
11、进一步地，所述nkg2d胞外结构域和pd1胞外结构域可通过连接肽连接。
12、进一步，所述连接肽可为自剪切多肽。
13、进一步地，所述连接nkg2d胞外结构域和pd1胞外结构域的连接肽的氨基酸序列可为seq id no.1第783-804位。
14、进一步地，所述嵌合抗原受体的跨膜区可为氨基酸序列是seq id no.1的第187-210位的cd8a跨膜区。
15、进一步地，所述嵌合抗原受体的胞内信号区还包括共刺激结构域和激活结构域。
16、进一步地，所述嵌合抗原受体的共刺激结构域可为共刺激结构域4-1bb。
17、进一步地，所述嵌合抗原受体的共刺激结构域4-1bb的氨基酸序列可为seq idno.1的第211-257位。
18、进一步地，所述嵌合抗原受体的激活结构域可为激活结构域cd3ζ。
19、进一步地，所述嵌合抗原受体的激活结构域cd3ζ的氨基酸序列可为seq id no.1的第258-369位。
20、进一步地，所述嵌合抗原受体自n末端至c末端分别为：所述抗cll1的单域抗体、所述cd8a铰链区、所述cd8a跨膜区、所述共刺激结构域4-1bb、所述激活结构域cd3ζ、所述nkg2d胞外结构域、所述连接肽、所述pd1胞外结构域。
21、进一步地，所述嵌合抗原受体包括下述任一种：
22、a1)氨基酸序列是seq id no.1第22-369位所示的蛋白质；
23、a1’)氨基酸序列是seq id no.1第22-1201位所示的蛋白质；
24、a2)将seq id no.1的第22-369位所示的氨基酸序列或seq id no.1的第22-1201位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)或a1’)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
25、a3)在a1)、a1’)或a2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的与a1)具有相同功能的融合蛋白质。
26、进一步地，所述的car-t细胞中，a3)中所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗CLL1的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含氨基酸序列是SEQ ID No.1第118-130位的HCDR3、氨基酸序列是SEQ ID No.1第72-79位的HCDR2和/或氨基酸序列是SEQID No.1第47-54位的HCDR1，所述HCDR3、HCDR2和HCDR1为3个互补决定区。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列为SEQ IDNo.1的第22-141位。
3.嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外区、跨膜区和胞内信号区，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外区含有权利要求1或2所述的单域抗体。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号区包括共刺激结构域4-1BB和融合蛋白，所述融合蛋白包括NKG2D胞外结构域和PD1胞外结构域。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述NKG2D胞外结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第389-782位，所述PD1胞外结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第805-1201位。
6.
7.含有权利要求1或2所述的单域抗体、权利要求3-5中任一所述的嵌合抗原受体和/或权利要求6中所述任一种生物材料的重组细胞。
8.制备权利要求7所述重组细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求6中所述的核酸分子转入受体细胞中稳定表达，得到所述重组细胞。
9.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求7所述的重组细胞。
10.应用，其特征在于，所述应用为权利要求1或2所述的单域抗体、权利要求3-5中任一所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的生物材料和/或权利要求7所述的重组细胞在下述D1)-D5)任一项中的应用和/或或权利要求8所述的药物组合物在D2)和/或D4)中的应用：
...【技术特征摘要】
1.抗cll1的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含氨基酸序列是seq id no.1第118-130位的hcdr3、氨基酸序列是seq id no.1第72-79位的hcdr2和/或氨基酸序列是seqid no.1第47-54位的hcdr1，所述hcdr3、hcdr2和hcdr1为3个互补决定区。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列为seq idno.1的第22-141位。
3.嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外区、跨膜区和胞内信号区，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外区含有权利要求1或2所述的单域抗体。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号区包括共刺激结构域4-1bb和融合蛋白，所述融合蛋白包括nkg2d胞外结构域和pd1胞外结构域。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述nkg2d胞外结构域的氨基酸序列为seq id no.1的第38...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱建高，杨文君，杨鑫，俞建东，
申请(专利权)人：浙江康佰裕生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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