【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy2及其制备方法与应用，属于生物技术。
技术介绍
1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性和高度传染性疾病，主要感染猪、牛与羊等偶蹄动物，其的传播与流行给我国畜牧养殖业造成了巨大损失，被世界动物卫生组织和联合国粮农组织列为a类烈性传染病。
2、目前世界上主要存在七种不同血清型的口蹄疫病毒，它们分别是o型、a型、c型、亚洲i型、南非i型、南非ii型和南非iii型，其中每种血清型又可以分为许多不同的血清亚型。口蹄疫病毒颗粒在形态上近似于球形，直径约25～30nm，没有囊膜，衣壳呈二十面体结构，由十二个五聚体组成，每个五聚体由五个原聚体组成，每个原聚体由vp1、vp2、vp3和vp4四个结构蛋白组成。其中vp1、vp2和vp3暴露于衣壳表面，而vp4完全内化在衣壳内部。目前我国主要存在o和a这两种血清型，其中血清a型具有最广泛的抗原变异，血清a型型内不同亚型之间往往不能交叉保护。到现在为止，我国关于口蹄疫病毒血清a型广谱中和抗体及其识别的广谱中和抗原表位的研究报道很少。
3、过去二十年，科学家们主要使用鼠源杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行口蹄疫病毒抗原特性的研究工作。对于a型口蹄疫病毒，利用抗体耐受突变株分析得出口蹄疫病毒逃逸突变的关键位点，确认了五个功能相互独立的抗原位点(图1)。位点1和位点3是口蹄疫病毒的主要抗原位点，由vp1蛋白的g-h环和c端组成，其中影响抗体结合的关键氨基酸残基位点主要包括144、148、154和208。位点2由vp2蛋白的b-c环或者e-
4、单链抗体(single chain antibody fragment，scfv)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一个10-25个氨基酸组成的柔性短肽连接而成，具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位，该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，并且去除了无关结构，具有更广泛的应用前景。作为一种新型抗体分子，单链抗体具有分子质量小、组织穿透力强、血中半衰期短，无交叉反应、容易基因操作、能在原核细胞中表达和易于大量生产等优点，并且可以用化学偶联或基因工程方法与其他靶标分子构建融合蛋白。同时单链抗体作为抗体药物也引起了广泛的关注，例如beovu是在美国获批的一款新一代眼科药物，其活性药物成分brolucizumab就是一种人源化单链抗体片段，靶向所有类型的血管内皮生长因子-a(vegf-a)。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy2及其制备方法与应用。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy2，所述中和抗体hy2重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、根据本专利技术优选的，所述中和抗体hy2为重链可变区和轻链可变区融合的单链抗体，所述重链可变区和轻链可变区之间连接有柔性多肽接头，且所述重链可变区位于n端，所述轻链可变区位于c端。
5、进一步优选的，所述柔性多肽接头的氨基酸序列如seq id no.3所示。
6、根据本专利技术优选的，所述中和抗体hy2的n端和/或c端连接有纯化标签。
7、进一步优选的，所述纯化标签为flag-tag标签和his标签中的至少一种；所述flag-tag标签和his标签的氨基酸序列均如seq id no.4所示。
8、第二方面，本专利技术提供了一种编码上述中和抗体hy2的基因片段，其中，编码所述中和抗体hy2重链可变区的基因序列如seq id no.6所示，编码所述中和抗体hy2轻链可变区的基因序列如seq id no.7所示。
9、第三方面，本专利技术提供了一种含有上述第二方面所述的基因片段的表达载体。
10、第四方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合有上述第二方面所述的基因片段。
11、为了便于表达的所述中和抗体hy2从细胞内分泌到细胞外，可以在编码本专利技术中和抗体hy2的核酸的5’端或3’端融合编码信号肽的核酸，所述信号肽的氨基酸序列如seqid no.5所示。不过，当融合有信号肽的单链抗体在表达后，信号肽会被切割下来，获得不含信号肽的单链抗体。
12、第五方面，本专利技术提供了上述中和抗体hy2的制备方法，包括步骤如下：
13、(1)采用a型口蹄疫病毒对牛进行第一次免疫，第一次免疫后28天内，进行第二次免疫；
14、(2)第二次免疫后，分离外周血单个核细胞，然后利用诱饵抗原和荧光抗体进行筛选和标记，得到口蹄疫病毒血清a型特异性b细胞；
15、(3)以步骤(2)所得口蹄疫病毒血清a型特异性b细胞的cdna为模板，扩增得到牛单个b细胞igg抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；
16、(4)将步骤(3)所得重链和轻链的可变区基因通过柔性多肽接头连接，再于两端分别引入信号肽和纯化标签，然后插入到pcdna3.4表达载体中，得到pcdna3.4-scfv质粒；
17、(5)将步骤(4)所得pcdna3.4-scfv质粒转染至cho-s细胞，取转染细胞培养后取上清，经纯化后，得到a型口蹄疫病毒中和抗体hy2。
18、根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述第一次免疫的a型口蹄疫病毒为fmdv a/af/72，第二次免疫的a型口蹄疫病毒为fmdv a/wh/cha/09。
19、第六方面，本专利技术提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
20、a、上述第一方面所述的中和抗体hy2；
21、b、和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或vlp、或其组合。
22、第七方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的中和抗体hy2在制备a型口蹄疫病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
23、第八方面，本专利技术提供了一种a型口蹄疫病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述第一方面所述的中和抗体hy2。
24、优选地，所述检测试剂盒还包括酶标板、抗体稀释液、浓缩洗涤液、显色剂、终止液。
25、第九方面，本专利技术提供了一种上述第一方面所述的中和抗体hy2在制备预防或治疗a型口蹄疫病毒感染药物中的应用。
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1.一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY2，其特征在于，所述中和抗体HY2重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的A型口蹄疫病毒中和抗体HY2，其特征在于，所述中和抗体HY2为重链可变区和轻链可变区融合的单链抗体，所述重链可变区和轻链可变区之间连接有柔性多肽接头，且所述重链可变区位于N端，所述轻链可变区位于C端；所述中和抗体HY2的N端和/或C端连接有纯化标签；
3.一种编码权利要求1所述中和抗体HY2的基因片段，其特征在于，编码所述中和抗体HY2重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述中和抗体HY2轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
4.一种含有权利要求2所述中和抗体HY2的基因片段的表达载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求3所述中和抗体HY2的基因片段。
6.权利要求1所述中和抗体HY2的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
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1.一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy2，其特征在于，所述中和抗体hy2重链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.如权利要求1所述的a型口蹄疫病毒中和抗体hy2，其特征在于，所述中和抗体hy2为重链可变区和轻链可变区融合的单链抗体，所述重链可变区和轻链可变区之间连接有柔性多肽接头，且所述重链可变区位于n端，所述轻链可变区位于c端；所述中和抗体hy2的n端和/或c端连接有纯化标签；
3.一种编码权利要求1所述中和抗体hy2的基因片段，其特征在于，编码所述中和抗体hy2重链可变区的基因序列如seq id no.6所示，编码所述中和抗体hy2轻链可变区的基因序列如seq id no.7所示。
4.一种含有权利要...
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