【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及一种鼠源膜组织延伸刺突蛋白(膜突蛋白)的ferm结构域的制备。所述ferm结构域对于研究膜突蛋白的结构及功能具有重要意义。
技术介绍
1、ferm结构域由三个亚结构域(裂片)f1-f3组成，存在于多种蛋白质中，其名称来源于最早发现该结构域的erm蛋白家族。erm蛋白参与多种生理过程，包括细胞骨架与质膜之间的连接、细胞微绒毛的形成、细胞的黏附、迁移、附着、转录、翻译等，并且参与多条信号通路(infect immun,1999,67:460)。另外大量实验已证实erm蛋白参与肿瘤细胞的侵袭过程，在某些癌症的发生、发展过程中发挥了一定的作用。因此深入研究erm蛋白的结构与功能对于揭示细胞相关的生理过程机理，了解疾病的发生机制具有深刻意义。
2、膜突蛋白属于erm蛋白家族的一员。膜突蛋白具有三个结构域：n-末端的ferm结构域、中心螺旋结构域和c-末端结构域(biol cell,2012,92:305)。膜突蛋白的ferm结构域位于其n-末端，与跨膜蛋白、信号蛋白及磷脂分子产生相互作用，参与一系列的生理过程，并参与重要的信号传导过程(cell bio,2002,3:586)。当膜突蛋白的n-末端ferm结构域与c-末端结构域之间发生直接相互作用的时候，膜突蛋白上大部分的结合位点被掩盖，该蛋白处于静息状态。当ferm结构域与pip2发生相互作用以及特定的苏氨酸t558位点磷酸化时，n-末端ferm结构域和c-末端结构域互相分离，休眠的蛋白被活化(cell,2000,101:259)。
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技术实现思路
1、本专利技术提供了一种鼠源膜组织延伸刺突蛋白ferm结构域的制备方法，可以用于体外研究膜突蛋白的激活状态。
2、利用基因工程手段对鼠源膜突蛋白的ferm结构域的编码基因进行改造，获得重组蛋白的编码基因，其核苷酸序列为seq id no：1所示，氨基酸序列如seq id no：2所示，含tev酶切位点和6×his组氨酸亲和标签。所述的核苷酸序列基于鼠源膜突蛋白的ferm结构域的编码基因进行密码子优化，得到偏好于大肠肝菌表达的核苷酸序列。具体步骤为：根据ferm结构域的基因序列和pet-28a载体基因信息设计上下游引物，通过pcr手段扩增得到ferm结构域基因。所述扩增引物序列：
3、上游引物序列：5’-acc tgg cagagcatc tca catatc cagagc gcg att gaaaccgtatttagg tat gccagg ccgagtag-3’；
4、下游引物序列：5’–ctg cgt cga gat tcg gtt cat gac caa ctc tcatgc-3’；
5、进一步地，将ferm结构域基因与载体pet-28a基因进行双酶切获得空载体基因片段和ferm结构域基因片段；再通过t4 dna连接酶的作用下将基因片段与空载体基因片段连接，获得重组质粒；
6、进一步地，将重组质粒转化到肠杆菌表达细胞bl21(de3)中，通过亲和层析提取、离子交换层析纯化，获得高纯度蛋白；
7、进一步地，通过tev酶切除重组蛋白上的组氨酸亲和标签(6×his)；
8、进一步地，通过亲和层析去除tev蛋白酶得到鼠源膜突蛋白ferm结构域。
9、与现有技术相比，本专利技术所提供的技术方案的优势是：
10、(1)本专利技术公开的膜突蛋白ferm的制备方法便捷高效，设计的扩增ferm结构域的引物在结合上具有特异性。
11、(2)本专利技术公开的膜突蛋白ferm结构域的制备方法能够提取高纯度且稳定性能高的蛋白。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于制备鼠源膜突蛋白的FERM结构域的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于，根据鼠源膜突蛋白的FERM结构域的编码基因核苷酸序列进行密码子优化，得到偏好于大肠肝菌表达的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利2所述的核苷酸、组氨酸标签和蛋白酶酶切位点。
4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
5.权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为E.coliBL21(DE3)。
6.权利要求1所述的重组蛋白的表达及纯化，其特征在于，包括如下步骤：构建重组表达载体、转化宿主细胞、菌种培养、诱导直到表达出重组蛋白，并且进行纯化。
7.鼠源膜突蛋白的FERM结构域的制备，其特征在于，通过TEV蛋白酶对权利要求6获得的重组蛋白进行酶切。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：TEV酶切的
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所需的缓冲液为Tris-HCl缓冲液，缓冲液的pH＝7.5。
...【技术特征摘要】
1.一种用于制备鼠源膜突蛋白的ferm结构域的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示；所述重组蛋白的编码基因核苷酸序列如seq id no：2所示。
2.权利要求1所述的重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于，根据鼠源膜突蛋白的ferm结构域的编码基因核苷酸序列进行密码子优化，得到偏好于大肠肝菌表达的核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利2所述的核苷酸、组氨酸标签和蛋白酶酶切位点。
4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
5.权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄方，朱文慧，张庆硕，虎祥，钱爱枝，赵锦程，王晓娟，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：
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