工程化CRISPR-CAS蛋白质及其使用方法技术

本文描述了工程化CRISPR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化CRISPR
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CAS蛋白质及其使用方法
[0001]关于序列表的电子申请的声明
[0002]提供了ASCII文本格式的序列表来代替纸质副本，该序列表根据37 C.F.R.
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1.821提交，命名为1499
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37WO_ST25，大小为922,217字节，生成于2021年8月27日，并通过EFS
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Web提交。此序列表就其公开内容在此通过引用并入说明书中。


[0003]本专利技术涉及工程化蛋白质(例如，工程化酶)和使用此类蛋白质的方法。本专利技术还涉及用于修饰或编辑靶核酸的组合物和系统。

技术介绍

[0004]II型CRISPR核酸内切酶(包括广泛使用的SpCas9)共有共同的DNA切割机制。该家族中的酶包含两个核酸酶结构域(HNH和RuvC)，其各自切割单条DNA链。当Cas9
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sgRNA复合物(或Cas9
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crRNA
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trRNA复合物)与其靶DNA序列结合时，靶DNA链与RNA间隔区序列结合，而非靶DNA链形成单链环。Cas9的HNH结构域切割靶DNA链，RuvC结构域切割非靶链(图1)。如图1所示，对于II型CRISPR核酸内切酶(例如Cas9)，靶DNA链和非靶DNA链分别被HNH和RuvC结构域同时切割，形成平端双链断裂。
[0005]与II型CRISPR核酸内切酶不同，V型CRISPR核酸内切酶(例如Cas12a)只有一个核酸酶结构域，它从非靶链开始依次切割两条DNA链。如图2所示，对于V型核酸内切酶(例如Cas12a)，RuvC结构域依次切割非靶DNA链和靶DNA链，导致交错的双链断裂。
[0006]尽管II型和V型CRISPR核酸内切酶行使相似的功能，但它们的机制和结构却截然不同。这两种不同的类型被认为是从不同的前体进化而来的，并且只有RuvC结构域在这两种类型之间共有任何重要的序列或结构同源性。V型CRISPR核酸内切酶缺乏负责II型酶中靶链切割的HNH结构域。相反，V型CRISPR核酸内切酶中的RuvC结构域从非靶链开始依次切割两条DNA链(图2)。因此，突变RuvC结构域的催化残基阻止所有核酸酶活性并产生失活的酶，而不是产生靶链切口酶。已在Cas12a中鉴定出非靶链切口酶突变；然而，这种突变在RuvC结构域之外，并且被认为是通过降低酶的整体催化效率来发挥作用的。不存在V型CRISPR靶链切口酶，并且鉴于V型CRISPR核酸内切酶与II型CRISPR核酸内切酶相比在结构和作用机制上的差异，没有明确的生产方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一方面涉及包含至少两种不同多肽的工程化蛋白质，其中至少两种不同多肽中的一种是第一CRISPR
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Cas效应多肽，其是第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白的第一部分并且第一CRISPR
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Cas效应多肽没有核酸酶结构域；并且其中至少两种不同多肽中的另一种是异源多肽，其与V型CRISPR
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Cas效应蛋白是异源的并且不是V型CRISPR
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Cas效应蛋白的一部分。
[0008]本专利技术的另一方面涉及工程化蛋白质，其包含：第一核酸酶结构域，其中第一核酸
酶结构域是靶链切口酶结构域或其部分，其中第一核酸酶结构域不是V型核酸酶结构域或其部分；并且第一CRISPR
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Cas效应多肽是V型CRISPR
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Cas效应蛋白的一部分。在一些实施方案中，第一核酸酶结构域是靶链特异性切口酶结构域或靶链切口酶结构域和非靶链切口酶结构域。
[0009]本专利技术的另一方面涉及工程化蛋白质，其包含：第一多肽，其是第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白的第一部分；第二多肽，其是第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白的第二部分；和与第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白异源的异源多肽，其中所述异源多肽位于第一多肽和第二多肽之间，并且异源多肽位于工程化蛋白质中对应于第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白的域间接头区域的位置。
[0010]本专利技术的另一方面涉及工程化蛋白质，其包含与SEQ ID NO：2
‑
17或125
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132中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，任选地，其中所述工程化蛋白质包含SEQ ID NO：2
‑
17或125
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132中任一个的氨基酸序列。
[0011]本专利技术的另一方面涉及一种组合物(例如，碱基编辑组合物)或系统，其包含：如本文所述的工程化蛋白质；引导核酸(例如，引导RNA)，和任选地脱氨酶，任选地，其中所述工程化蛋白质、引导核酸和任选地脱氨酶形成复合物或包含在复合物中。
[0012]本专利技术的另一方面涉及复合物，其包含：如本文所述的工程化蛋白质；引导核酸(例如，引导RNA)；和任选地脱氨酶。
[0013]本专利技术的另一方面涉及一种核酸分子，其包含编码如本文所述的工程化蛋白质的核苷酸序列。
[0014]本专利技术的另一方面涉及修饰靶核酸的方法，该方法包括：使靶核酸与如本文所述的工程化蛋白质和引导核酸(例如，引导RNA)接触，任选地，其中所述工程化蛋白质和引导核酸形成复合物或包含在复合物中，从而修饰靶核酸。
[0015]本专利技术的另一方面涉及提高修饰靶核酸的效率的方法，该方法包括：使靶核酸与如本文所述的工程化蛋白质和引导核酸(例如，引导RNA)接触，任选地，其中所述工程化蛋白质和引导核酸形成复合物或包含在复合物中，从而修饰靶核酸。
[0016]本专利技术还提供了包含本专利技术的核酸构建体的表达盒和/或载体，以及包含本专利技术的多肽、融合蛋白和/或核酸构建体的细胞。此外，本专利技术提供了包含本专利技术的核酸构建体和包含其的表达盒、载体和/或细胞的试剂盒。
[0017]值得注意的是，相对于一个实施方案描述的本专利技术的各方面可以并入不同的实施方案中，尽管相对于其没有具体描述。即，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合进行组合。申请人保留更改任何最初提交的权利要求和/或相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何最初提交的权利要求以依赖和/或合并任何其他一项或多项权利要求的任何特征的权利，尽管最初没有以这种方式进行主张。本专利技术的这些和其他目的和/或方面在下面阐述的说明书中详细解释。本领域普通技术人员通过阅读附图和随后的优选实施方案的详细描述来理解本专利技术的其他特征、优点和细节，这样的描述仅是对本专利技术的说明。
[0018]附图简述
[0019]图1是描绘II型CRISPR核酸内切酶的作用机制的图示。
[0020]图2是描绘V型CRISPR核酸内切酶的作用机制的图示。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含至少两种不同多肽的工程化蛋白质，其中至少两种不同多肽中的一种是第一CRISPR
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Cas效应多肽，其是第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白的第一部分，并且第一CRISPR
‑
Cas效应多肽没有核酸酶结构域；和其中至少两种不同多肽中的另一种是异源多肽，其与第一V型CRISPR
‑
Cas效应蛋白是异源的并且不是V型CRISPR
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Cas效应蛋白的一部分。2.权利要求1的工程化蛋白质，其中所述异源多肽具有约10至约200个氨基酸的长度和/或第一CRISPR
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Cas效应多肽具有约100至约400个氨基酸的长度，任选地，其中所述异源多肽具有约140至约160个氨基酸的长度和/或第一CRISPR
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Cas效应多肽具有约250至约350个氨基酸的长度。3.权利要求1或2的工程化蛋白质，其中所述异源多肽包含与第一CRISPR
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Cas效应多肽异源的第一核酸酶结构域或其部分。4.权利要求1
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3中任一项的工程化蛋白质，其中所述异源多肽包含靶链切口酶结构域或其部分，任选地，其中所述异源多肽包含靶链特异性切口酶结构域、非靶链特异性切口酶结构域或靶链切口酶结构域和非靶链切口酶结构域。5.权利要求1
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4中任一项的工程化蛋白质，其还包含含有第二核酸酶结构域或其部分的第二CRISPR
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Cas效应多肽，任选地，其中所述第一CRISPR
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Cas效应多肽和所述第二CRISPR
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Cas效应多肽是非连续的(即彼此分开(任选地相隔至少10、50、100或更多个氨基酸)并且彼此不直接相连)。6.权利要求5的工程化蛋白质，其中所述异源多肽与所述第二CRISPR
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Cas效应多肽是异源的。7.权利要求5或6的工程化蛋白质，其中所述第一CRISPR
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Cas效应多肽和第二CRISPR
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Cas效应多肽各自是同一CRISPR
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Cas效应蛋白的一部分(例如，不同的部分)。8.权利要求5
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7中任一项的工程化蛋白质，其中所述第二核酸酶结构域或其部分是非靶链和靶链切口酶结构域或其部分。9.权利要求5
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8中任一项的工程化蛋白质，其中所述第二核酸酶结构域是有活性的。10.权利要求5
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8中任一项的工程化蛋白质，其中所述第二核酸酶结构域是无活性的。11.权利要求1
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10中任一项的工程化蛋白质，其中所述异源多肽包含HNH结构域，任选地，其中所述HNH结构域包含修饰HNH结构域的活性的突变(例如，H840A突变)。12.权利要求5
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11中任一项的工程化蛋白质，其中所述第一CRISPR
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Cas效应多肽和第二CRISPR
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Cas效应多肽各自是第一CRISPR
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Cas效应蛋白的一部分并且所述异源多肽在作为第一CRISPR
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Cas效应蛋白的两个连续或非连续氨基酸的两个氨基酸之间和/或连接至(例如，直接或间接)作为第一CRISPR
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Cas效应蛋白的两个连续或非连续氨基酸的两个氨基酸。13.权利要求12的工程化蛋白质，其中所述异源多肽位于工程化蛋白质中对应于第一CRISPR
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Cas效应蛋白的域间接头区域的位置。14.权利要求1
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13中任一项的工程化蛋白质，其中所述异源多肽包含与SEQ ID NO：1或169
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174中的一个或多个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，任选地，其中所述异源多肽包含SEQ ID NO：1或169
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174中任一个的氨基酸序列。
15.权利要求5
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14中任一项的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质在氨基末端到羧基末端的方向上包含第一CRISPR
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Cas效应多肽、异源多肽和第二CRISPR
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Cas效应多肽，任选地，其中第二CRISPR
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Cas效应多肽具有约800至约1,100个氨基酸(例如，约900至约950或1,000个氨基酸)的长度。16.权利要求1
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15中任一项的工程化蛋白质，其还包含第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白的楔形结构域、Rec1结构域、Rec2结构域、PAM相互作用结构域、RuvC结构域、桥螺旋和/或Nuc结构域中的全部或一部分，任选地，其中所述工程化蛋白质包含Cas12a或Cas12b的楔形结构域、Rec1结构域、Rec2结构域、PAM相互作用结构域、RuvC结构域、桥螺旋和/或Nuc结构域中的全部或一部分。17.权利要求16的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质包含Rec1结构域和Rec2结构域，并且所述异源多肽位于Rec1结构域和Rec2结构域之间。18.权利要求1
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17中任一项的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质缺乏第一V型CRISPR
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Cas效应蛋白的至少一部分，任选地，其中所述工程化蛋白质缺乏Cas12a或Cas12b的至少一部分。19.权利要求5
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18中任一项的工程化蛋白质，其还包含在第一CRISPR
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Cas效应多肽和异源多肽之间的第一接头和/或在异源多肽和第二CRISPR
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Cas效应多肽之间的第二接头。20.权利要求19的工程化蛋白质，其中所述第一接头和/或第二接头包含1至10个氨基酸，任选地，其中所述第一接头和/或第二接头包含1、2、3或4个氨基酸。21.权利要求19或20的工程化蛋白质，其中所述第一接头和/或第二接头包含甘氨酸和/或丝氨酸。22.权利要求1
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21中任一项的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质包含与野生型CRISPR
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Cas效应蛋白的氨基酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，任选地，其中所述工程化蛋白质包含与SEQ ID NO：50
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66或151中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列。23.权利要求1
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22中任一项的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质包含与SEQ ID NO：2
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17、125
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132或157
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168中的任一个具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，任选地，其中所述工程化蛋白质包含SEQ ID NO：2
‑
17、125
‑
132或157
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168中任一个的氨基酸序列。24.权利要求1
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23中任一项的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质是核酸酶，任选地，其中所述工程化蛋白质是靶链切口酶、非靶链切口酶或靶链和非靶链切口酶。25.权利要求1
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24中任一项的工程化蛋白质，其中与CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，野生型CRISPR
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Cas效应蛋白和/或具有SEQ ID NO：50
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66或151之一的序列的蛋白质)相比，工程化蛋白质具有增加的使靶核酸的靶链和/或非靶链产生切口的效率。26.一种工程化蛋白质，其包含：第一核酸酶结构域，其中第一核酸酶结构域是靶链切口酶结构域或其部分，其中第一核酸酶结构域不是V型核酸酶结构域或其部分；和第一CRISPR
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Cas效应多肽，其是V型CRISPR
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Cas效应蛋白的一部分。27.权利要求26的工程化蛋白质，其中所述第一核酸酶结构域是靶链特异性切口酶结
构域或靶链切口酶结构域和非靶链切口酶结构域。28.权利要求27或28的工程化蛋白质，其还包含第二核酸酶结构域，任选地，其中所述第二核酸酶结构域是非靶链和靶链切口酶结构域或其部分。29.权利要求28的工程化蛋白质，其中所述第二核酸酶结构域是有活性的。30.权利要求28的工程化蛋白质，其中所述第二核酸酶结构域是无活性的。31.权利要求26
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30中任一项的工程化蛋白质，其中所述第一核酸酶结构域包含HNH结构域，任选地，其中所述HNH结构域包含失活突变(例如H840A突变)。32.权利要求28
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31中任一项的工程化蛋白质，其中所述第一CRISPR
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Cas效应多肽和第二核酸酶结构域各自是第一CRISPR
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Cas效应蛋白的一部分并且所述第一核酸酶结构域位于第一CRISPR
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Cas效应蛋白的两个连续或非连续氨基酸之间和/或连接至(例如，直接或间接)第一CRISPR
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Cas效应蛋白的两个连续或非连续氨基酸。33.权利要求33的工程化蛋白质，其中所述第一核酸酶结构域位于工程化蛋白质中对应于第一CRISPR
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Cas效应蛋白的域间接头区域的位置。34.权利要求26
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33中任一项的工程化蛋白质，其中所述第一核酸酶结构域包含与SEQ ID NO：1或169
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174中的一个或多个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列，任选地其中所述第一核酸酶结构域包含SEQ ID NO：1或169
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174中任一个的氨基酸序列。35.权利要求26
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34中任一项的工程化蛋白质，其进一步在氨基末端到羧基末端的方向上包含第一CRISPR
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Cas效应多肽、第一核酸酶结构域和第二核酸酶结构域。36.权利要求26
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35中任一项的工程化蛋白质，其还包含V型CRISPR
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Cas效应蛋白的楔形结构域、Rec1结构域、Rec2结构域、PAM相互作用结构域、RuvC结构域、桥螺旋和/或Nuc结构域中的全部或一部分，任选地，其中所述工程化蛋白质包含Cas12a或Cas12b的楔形结构域、Rec1结构域、Rec2结构域、PAM相互作用结构域、RuvC结构域、桥螺旋和/或Nuc结构域中的全部或一部分。37.权利要求36的工程化蛋白质，其中所述工程化蛋白质包含Rec1结构域和Rec2结构域并且第一核酸酶结构域位于Rec1结构域和Rec2结...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：成对植物服务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：