用于等位基因的RNA编码的DNA替换的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及包含CRISPR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于等位基因的RNA编码的DNA替换的组合物和方法
[0001]关于电子提交序列表的声明
[0002]代替纸质副本，提供了以ASCII文本格式的序列表，其按照37C.F.R.
§
1.821递交，名称为1499.57.WO_ST25.txt，大小为1,043,362个字节，于2021年11月5日生成，并且经由EFS
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Web提交。该序列表通过关于其公开内容在说明书中提及而特此合并入本文。
[0003]优先权声明
[0004]本申请按照35U.S.C.
§
119(e)要求于2020年11月6日提交的美国临时申请号63/110,386(其整个内容通过提及而合并入本文)的权益。
专利

[0005]本专利技术涉及包含CRISPR
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Cas效应蛋白、逆转录酶和延伸型指导核酸的重组核酸构建体，以及使用其来在植物中修饰核酸的方法。
[0006]专利技术背景
[0007]碱基编辑已显示出是分别将胞嘧啶和腺嘌呤残基改变为胸腺嘧啶和鸟嘌呤的有效方式。这些工具虽然强大，但确实有一些限制，例如旁观者碱基，小的碱基编辑窗口(其给出有限的对于性状相关靶标的可及性，除非具有高PAM密度的酶可用于进行补偿)，有限的分别将胞嘧啶和腺嘌呤转变为除了胸腺嘧啶和鸟嘌呤之外的其他残基的能力，以及没有编辑胸腺嘧啶或鸟嘌呤残基的能力。因此，目前的可用于碱基编辑的工具是有限的。因此，为了通过对于更多数目的生物增加可能编辑的范围来使得核酸编辑更有用，需要新的编辑工具。
[0008]专利技术概述
[0009]在第一个方面，提供了修饰靶核酸的方法，所述方法包括：使所述靶核酸与下列组分相接触：(a)V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白；(b)逆转录酶，和(c)延伸型指导核酸(extended guide nucleic acid)(例如，延伸型II型或V型CRISPR RNA、延伸型II型或V型CRISPR DNA、延伸型II型或V型crRNA、延伸型II型或V型crDNA)，由此修饰所述靶核酸。
[0010]在第二个方面，提供了修饰靶核酸的方法，所述方法包括：使所述靶核酸在第一位点处与下列组分相接触：(a)(i)第一CRISPR
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Cas效应蛋白；和(ii)第一延伸型指导核酸(例如，延伸型CRISPR RNA、延伸型CRISPR DNA、延伸型crRNA、延伸型crDNA)；和(b)(i)第二CRISPR
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Cas效应蛋白，(ii)第一逆转录酶；和(ii)第一指导核酸，由此修饰所述靶核酸。
[0011]在第三个方面，提供了在植物或植物细胞中修饰靶核酸的方法，其包括将本专利技术的表达盒引入到所述植物或植物细胞中，由此在所述植物或植物细胞中修饰所述靶核酸，并且产生包含所述经修饰的靶核酸的植物或植物细胞。
[0012]在第四个方面，提供了复合物，其包含：(a)V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白；(b)逆转录酶；和(c)延伸型指导核酸(例如，延伸型CRISPR RNA、延伸型CRISPR DNA、延伸型crRNA、延伸型crDNA，例如所靶向的等位基因指导(tag)核酸(即，tagDNA、tagRNA))。
[0013]在第五个方面，提供了经密码子优化以用于在生物中进行表达的表达盒，所述表达盒以5'至3'包含：(a)编码植物特异性启动子序列(例如，ZmUbi1、MtUb2、RNA聚合酶II(Pol II))的多核苷酸，(b)经植物密码子优化的编码V型CRISPR
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Cas核酸酶(例如，Cpf1(Cas12a)、dCas12a等)的多核苷酸；(c)连接体序列；和(d)经植物密码子优化的编码逆转录酶的多核苷酸。
[0014]在第六个方面，提供了经密码子优化以用于在生物中进行表达的表达盒，所述表达盒包含：(a)编码启动子序列的多核苷酸，和(b)延伸型RNA指导序列，其中所述延伸型指导核酸包含延伸部分，所述延伸部分在其3'末端处包含引物结合位点和待被掺入到所述靶核酸中的编辑(例如，逆转录酶模板)，任选地其中所述延伸型指导核酸被包含在表达盒中，任选地其中所述延伸型指导核酸可操作地连接至Pol II启动子。
[0015]本专利技术进一步提供了包含通过本专利技术的方法进行修饰的靶核酸的细胞，包括植物细胞、细菌细胞、古细菌细胞、真菌细胞、动物细胞，以及包含所述细胞的生物，包括植物、细菌、古细菌、真菌和动物。另外，本专利技术提供了包含本专利技术的多核苷酸、多肽和表达盒的试剂盒。
[0016]本专利技术的这些和其他方面在下面的专利技术描述中更详细地进行阐述。
[0017]附图简述
[0018]图1提供了示意图，其显示了从crRNA的逆转录生成DNA序列并且随后整合到切口位点中。延伸型指导crRNA(tagRNA)与Cpf1切口酶(cas12a切口酶)(nCpf1，左上)相结合。备选地，编码编辑模板的延伸可以位于crRNA的5'。crRNA的3'末端与DNA在所述切口位点处互补(非粗体配对线，左上)。nCpf1可以共价连接至逆转录酶(RT)，或者RT可以被募集至nCpf1，在这种情况下多个逆转录酶蛋白可以被募集至nCpf1。RT在第二链上从DNA切口的3'末端开始对DNA进行聚合，从而生成与crRNA互补的DNA序列，具有与基因组不互补的核苷酸(加粗的配对线，大括号，右上)，随后为互补的核苷酸(非粗体配对线，右上)。解离后，所得的DNA具有延伸型ssDNA，其具有3'突出端，其是与原始DNA(非加粗的配对线，右下)在很大程度上相同的序列，但是具有一些非天然核苷酸(加粗的配对线，大括号，右下)。该翼片(flap)与具有5'突出端的结构(左下)处于平衡状态，其中存在掺入到DNA中的错配的核苷酸。该平衡可以通过减少错配修复、在修复和复制期间去除5'翼片和还有对第一链产生切口(如本文中所描述的)而被驱动朝向左边的结构。
[0019]图2提供了示意图，其显示了用于减少错配修复的方法。为了驱动所述平衡更有利于形成具有经修饰的核苷酸(加粗的，大括号)的最终产物，引导切口酶(经由指导核酸)在RT编辑区域之外的区域(闪电箭头)中
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离在第二链(例如，靶标链或上部链)中的切口一定距离
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切割靶核酸的第一链(例如，靶标链或下部链)。nCpf1:crRNA分子可以在编辑泡的任何一侧或两侧。对第一链(虚线)产生切口向细胞表明，在错配修复和复制期间，新掺入的核苷酸是正确的核苷酸，因此有利于具有新核苷酸的最终产物。驱动所述平衡朝向所希望的产物的其他可能方式可以包括去除5'翼片。
[0020]图3显示了备选的通过使用本专利技术的组合物来修饰核酸的方法，其中将两个切口引入到第二链中，并且由RT所引入的序列取代带双切口的WT序列并且由此更有效地被掺入到基因组中。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.修饰靶核酸的方法，所述方法包括：使所述靶核酸与下列组分相接触：(a)V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白；(b)逆转录酶，和(c)延伸型指导核酸(例如，延伸型II型或V型CRISPR RNA、延伸型II型或V型CRISPR DNA、延伸型II型或V型crRNA、延伸型II型或V型crDNA)，由此修饰所述靶核酸。2.权利要求1的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白或所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白、所述逆转录酶和所述延伸型指导核酸形成复合物或被包含在复合物中。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述延伸型指导核酸包含：(i)V型CRISPR核酸或II型CRISPR核酸(II型或V型CRISPR RNA、II型或V型CRISPR DNA、II型或V型crRNA、II型或V型crDNA)和/或V型CRISPR核酸或II型CRISPR核酸和tracr核酸(例如，II型或V型tracrRNA、II型或V型tracrDNA)；和(ii)包含引物结合位点和逆转录酶模板(RT模板)(RTT)的延伸部分。4.权利要求3的方法，其中所述延伸部分融合至所述CRISPR核酸的5'末端或3'末端(例如，5'至3'：重复序列
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间隔子
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延伸部分，或者延伸部分
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重复序列
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间隔子)，和/或融合至所述tracr核酸的5'或3'末端。5.权利要求3或权利要求4的方法，其中所述延伸型指导核酸的延伸部分从5'至3'包含RT模板和引物结合位点。6.权利要求1
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5中任一项的方法，其中所述延伸型指导核酸进一步包含结构化RNA基序。7.权利要求6的方法，其中所述结构化RNA基序位于所述延伸型指导核酸的3'末端处。8.权利要求6或权利要求7的方法，其中所述结构化RNA基序为AsCpf1BB(SEQ ID NO:189)、BoxB(SEQ ID NO:190)、假结(诱饵)(SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:203)、假结(tEvoPreQ1)(SEQ ID NO:191)、fmp结(SEQ ID NO:192)、mp结(SEQ ID NO:193)、MS2(SEQ ID NO:194)、PP7(SEQ ID NO:195)、SLBP(SEQ ID NO:196)、TAR(SEQ ID NO:197)和/或ThermoPh(SEQ ID NO:198)。9.权利要求6
‑
8中任一项的方法，其中所述结构化RNA基序为假结。10.权利要求9的方法，其中所述假结为包含SEQ ID NO:158的核酸序列的tEvoPreQ1假结或者包含SEQ ID NO:191的核酸序列的EvoPreQ1假结。11.权利要求9的方法，其中所述假结包含SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:203的核酸序列。12.权利要求5
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11中任一项的方法，其中所述靶核酸是双链的并且包含第一链和第二链，并且所述引物结合位点与所述靶核酸的第二链(非靶标，上部链)相结合。13.权利要求5
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11中任一项的方法，其中所述靶核酸是双链的并且包含第一链和第二链，并且所述引物结合位点与所述靶核酸的第一链相结合(例如，结合至所述靶标链，所述CRISPR
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Cas效应蛋白被募集至的同一链，下部链)。14.权利要求5
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11中任一项的方法，其中所述靶核酸是双链的并且包含第一链和第二链，并且所述引物结合位点与所述靶核酸的第二链(非靶标链，与所述CRISPR
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Cas效应蛋白被募集至的链相反的链)相结合。
15.权利要求3
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14中任一项的方法，其中所述引物结合位点(PBS)的长度为大约一个核苷酸至大约100个核苷酸，任选地其中所述PBS的长度为大约4个核苷酸至大约80个核苷酸，大约30个核苷酸至大约80个核苷酸，大约40个核苷酸至大约60个核苷酸，或者长度为大约8、16、24、32、40、48、56、64、72或80个核苷酸。16.权利要求3
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15中任一项的方法，其中所述RT模板(RTT)的长度为大约一个至大约100个核苷酸，任选地其中所述RTT的长度为大约35个核苷酸至大约100个核苷酸，大约35个核苷酸至大约80个核苷酸，任选地大约35个核苷酸至大约75个核苷酸，大约40个核苷酸至大约75个核苷酸，大约45个核苷酸至大约75个核苷酸，大约45个核苷酸至大约60个核苷酸，或者长度为大约36、40、44、47、50、52、55、63、72或74个核苷酸。17.权利要求3至16中任一项的方法，其中所述RTT的长度为大约35个核苷酸至大约75个核苷酸并且所述PBS的长度为大约30个核苷酸至大约80个核苷酸，任选地其中所述PBS的长度为大约8、16、24、32、40、48、56、64、72或80个核苷酸并且所述RTT的长度为大约36、40、44、47、50、52、55、63、72或74个核苷酸。18.权利要求3至17中任一项的方法，其中所述延伸型指导RNA的延伸部分经由连接体与所述CRISPR核酸和/或所述tracrRNA相连接。19.权利要求18的方法，其中所述连接体的长度为1至100个核苷酸。20.权利要求3至19中任一项的方法，其中当所述延伸部分位于所述crRNA的5'时，修饰所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白以降低(或消除)自加工RNA酶活性。21.前述权利要求中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白或所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白为融合蛋白和/或所述逆转录酶为融合蛋白，其中所述V型CRISPR
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Cas融合蛋白或II型CRISPR
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Cas融合蛋白、所述逆转录酶融合蛋白和/或所述延伸型指导核酸融合至一个或多个将所述逆转录酶募集至所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白或II型CRISPR
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Cas效应蛋白的组分，任选地所述一个或多个组分经由蛋白质
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蛋白质相互作用、蛋白质
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RNA相互作用和/或化学相互作用来进行募集。22.前述权利要求中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域的V型CRISPR
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Cas效应融合蛋白，并且所述逆转录酶为包含融合(连接)至与所述肽标签相结合的亲和多肽的逆转录酶结构域的逆转录酶融合蛋白，任选地其中所述靶核酸与两个或更多个逆转录酶融合蛋白相接触，或者所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的II型CRISPR
‑
Cas效应蛋白结构域的II型CRISPR
‑
Cas效应融合蛋白，并且所述逆转录酶为包含融合(连接)至与所述肽标签相结合的亲和多肽的逆转录酶结构域的逆转录酶融合蛋白，任选地其中所述靶核酸与两个或更多个逆转录酶融合蛋白相接触。23.权利要求22的方法，其中所述肽标签包括GCN4肽标签(例如，Sun
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Tag)、c
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Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸
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His亲和标签、RGD
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His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II、V5标签和/或VSV
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G表位。24.权利要求22或权利要求23的方法，其中所述肽标签包括两个或更多个拷贝的所述肽标签。25.权利要求22
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24中任一项的方法，其中所述亲和多肽为抗体、affibody、anticalin、
monobody和/或DARPin。26.权利要求25的方法，其中所述抗体为scFv抗体。27.前述权利要求中任一项的方法，其中所述延伸型指导核酸连接至RNA募集基序，并且所述逆转录酶为包含融合(连接)至与所述RNA募集基序相结合的亲和多肽的逆转录酶结构域的逆转录酶融合蛋白，任选地其中所述靶核酸连接至两个或更多个逆转录酶融合蛋白相接触，任选地其中所述延伸型指导RNA连接至两个或更多个RNA募集基序，任选地其中所述两个或更多个RNA募集基序为相同的RNA募集基序或不同的RNA募集基序。28.权利要求27的方法，其中所述募集基序位于所述延伸型指导核酸的延伸部分的3'末端处或者包埋在所述延伸部分中。29.权利要求27或权利要求28的方法，其中所述RNA募集基序和相应的亲和多肽为端粒酶Ku结合基序(例如，Ku结合发夹)和Ku的亲和多肽(例如，Ku异二聚体)；端粒酶Sm7结合基序和Sm7的亲和多肽；MS2噬菌体操纵基因茎
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环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)；PP7噬菌体操纵基因茎
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环和亲和多肽PP7外壳蛋白(PCP)；SfMu噬菌体Com茎
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环和亲和多肽Com RNA结合蛋白；PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem
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3mRNA结合因子(PUF)；和/或合成的RNA
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适体和相应的适体配体。30.权利要求27
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29中任一项的方法，其中所述RNA募集基序和相应的亲和多肽为MS2噬菌体操纵基因茎
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环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)，和/或PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem
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3mRNA结合因子(PUF)。31.权利要求21的方法，其中募集化学相互作用的所述一个或多个组分为雷帕霉素可诱导的FRB
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FKBP的二聚化；生物素
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链霉抗生物素蛋白；SNAP标签；Halo标签；CLIP标签；由化合物诱导的DmrA
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DmrC异二聚体；双功能配体(例如，两个蛋白质结合化学品融合在一起，例如二氢叶酸还原酶(DHFR))。32.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括使所述靶核酸与下列组分相接触：(a)CRISPR
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Cas效应蛋白；和(b)指导核酸，其中(i)所述CRISPR
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Cas效应蛋白对于位于离已经由所述II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白产生切口的在第二链上的位点大约10至大约125个碱基对处(5'或3')的在所述靶核酸的第一链上的位点产生切口或进行切割，或(ii)所述CRISPR
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Cas效应蛋白对于位于离已经由所述II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白产生切口的在第一链上的位点大约10至大约125个碱基对处(5'或3')的在所述靶核酸的第二链上的位点产生切口或进行切割，由此改善错配修复，其中所述CRISPR
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Cas效应蛋白为I型、II型、III型、IV型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白。33.权利要求21
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32中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas融合蛋白或II型CRISPR
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Cas融合蛋白融合至染色质调节肽。34.权利要求21
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33中任一项的方法，其中所述染色质调节肽融合至所述V型CRISPR
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Cas融合蛋白或II型CRISPR
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Cas融合蛋白的C
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末端和/或N
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末端。35.权利要求21
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34中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas融合蛋白或II型CRISPR
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Cas融合蛋白在其N
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末端处融合至逆转录酶，并且所述染色质调节肽融合至所述逆转录酶的N
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末端。36.权利要求33
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35中任一项的方法，其中所述染色质调节肽为CHD1(例如，SEQ ID NO:
199)、H1G(例如，SEQ ID NO:200)、HB1(例如，SEQ ID NO:201)和HN1(例如，SEQ ID NO:202)。37.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括使所述靶核酸与Dna2多肽和/或5'翼片核酸内切酶(FEN)，任选地FEN1多肽相接触。38.权利要求37的方法，其中所述FEN和/或Dna2多肽被过表达(在所述靶核酸存在下)。39.权利要求37或权利要求38的方法，其中所述FEN为包含融合至所述II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白或结构域的FEN结构域的融合蛋白，和/或其中所述Dna2多肽为包含融合至所述II型或V型CRISPR
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Cas效应蛋白或结构域的Dna2结构域的融合蛋白。40.前述权利要求中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域的V型CRISPR
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Cas融合蛋白，并且所述FEN为包含融合至与所述肽标签相结合的亲和多肽的FEN结构域的FEN融合蛋白，和/或其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合至肽标签的V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域的V型CRISPR
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Cas融合蛋白，并且所述Dna2多肽为包含融合至与所述肽标签相结合的亲和多肽的Dna2结构域的Dna2融合蛋白，任选地其中所述靶核酸与两个或更多个FEN融合蛋白和/或两个或更多个Dna2融合蛋白相接触，由此将所述FEN和/或Dna2募集至所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域和所述靶核酸。41.权利要求1
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39中任一项的方法，其中所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合(连接)至肽标签(例如，表位或多聚化表位)的II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域的II型CRISPR
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Cas融合蛋白，并且所述FEN为包含融合至与所述肽标签相结合的亲和多肽的FEN结构域的FEN融合蛋白，和/或其中所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合至肽标签的II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域的II型CRISPR
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Cas融合蛋白，并且所述Dna2多肽为包含融合至与所述肽标签相结合的亲和多肽的Dna2结构域的Dna2融合蛋白，任选地其中所述靶核酸与两个或更多个FEN融合蛋白和/或两个或更多个Dna2融合蛋白相接触，由此将所述FEN和/或Dna2募集至所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域和所述靶核酸。42.前述权利要求中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为Cas12a(Cpf1)结构域、Cas12b(C2c1)结构域、Cas12c(C2c3)结构域、Cas12d(CasY)结构域、Cas12e(CasX)结构域、Cas12g结构域、Cas12h结构域、Cas12i结构域、C2c4结构域、C2c5结构域、C2c8结构域、C2c9结构域、C2c10结构域、Cas14a结构域、Cas14b结构域和/或Cas14c结构域，或者所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白为Cas9结构域，任选地其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白和/或所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白包含一个或多个在本文中所描述的突变。43.权利要求42的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含通过参考SEQ ID NO:9的氨基酸位置编号而言的R1138A突变的LbCas12a切口酶，包含通过参考SEQ ID NO:2的氨基酸位置编号而言的R1226A突变的AsCas12a切口酶，包含通过参考SEQ ID NO:6的氨基酸位置编号而言的R1228A的FnCas12a，或包含通过参考SEQ ID NO:14的氨基酸位置编号而言的R1241A突变的PdCas12a切口酶。44.权利要求42的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)的V型CRISPR
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Cas效应蛋白(AsCas12a)或来自毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌的V型CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，LbCas12a)，或者从其而来的经修饰的V型CRISPR
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Cas效应蛋白。
45.权利要求42的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为来自亨盖特氏丁酸弧菌(Butyrivibrio hungatei)的V型CRISPR
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Cas效应蛋白(BhCas12)，或者从其而来的经修饰的V型CRISPR
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Cas效应蛋白。46.权利要求42的方法，其中所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白为Cas9效应蛋白/结构域，任选地来自链球菌属(Streptococcus)。47.权利要求1
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40或42
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46中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白包含降低的单链DNA切割活性(ss DNA酶活性)，或者被修饰(突变)以降低(或消除)ss DNA酶活性。48.权利要求1
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40或42
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47中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白被修饰(突变)以降低(或消除)自加工RNA酶活性。49.权利要求48的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为具有通过参考SEQ ID NO:1的氨基酸位置编号而言的H759A突变的Cas12a CRISPR
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Cas效应蛋白。50.权利要求49的方法，其中所述具有H759A突变的Cas12aCRISPR
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Cas效应蛋白包含与SEQ ID NO:148的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列。51.权利要求50的方法，其中所述具有H759A突变的Cas12aCRISPR
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Cas效应蛋白为与SEQ ID NO:148的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的LbCas12a CRISPR
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Cas效应蛋白。52.前述权利要求中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白被修饰以降低或消除核酸酶活性(例如，在核酸酶活性位点中(例如，在RuvC结构域中)的突变)，或者所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白被修饰以降低或消除核酸酶活性(例如，核酸酶活性位点中(例如，在RuvC或HNH结构域中)的突变)，以产生失活的V型CRISPR
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Cas效应蛋白或失活的II型CRISPR
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Cas效应蛋白(例如，deadCas(dCas、dCas12a、dCas9))。53.权利要求52的方法，其中所述失活的V型CRISPR
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Cas效应蛋白或所述失活的II型CRISPR
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Cas效应蛋白包含切口酶活性。54.权利要求52或权利要求53的方法，其中所述失活的V型CRISPR
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Cas效应蛋白或所述失活的II型CRISPR
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Cas效应蛋白融合至产生切口的酶(例如，Fok1、BFi1，例如经改造的Fok1或BFiI)。55.前述权利要求中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白包含氨基酸修饰以降低所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白的DNA结合亲和力。56.权利要求55的方法，其中所述修饰为氨基酸置换。57.权利要求55或权利要求56的方法，其中所述修饰为至丙氨酸的氨基酸置换，任选地其中所述丙氨酸替换带正电荷的氨基酸残基。58.权利要求57的方法，其中所述氨基酸置换为通过参考SEQ ID NO:148的氨基酸位置编号而言的K167A、K272A和/或K349A。59.权利要求58的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含通过参考SEQ ID NO:148的氨基酸位置编号而言的K167A、K272A、K349A、K167A+K272A、K167A+K349A、K272A+K349A或K167A+K272A+K349A的氨基酸置换的Cas12a CRISPR
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Cas效应蛋白，任选地其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为LbCas12a。60.前述权利要求中任一项的方法，其中所述逆转录酶包含氨基酸修饰。61.权利要求60的方法，其中所述氨基酸修饰为氨基酸置换。62.权利要求61的方法，其中所述氨基酸置换为通过参考SEQ ID NO:172的氨基酸位置
编号而言的L139P、D200N、W388R、E607K、T306K、W313F、F155Y、H638G、Q221R、V223M和/或D524N。63.权利要求61或权利要求62的方法，其中所述逆转录酶包含通过参考SEQ ID NO:172的氨基酸位置编号而言的L139P、D200N、W388R和E607K；L139P、D200N、T306K、W313F、W388R和E607K；5M(T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A)、F155Y和H638G；5M(T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A)、Q221R和V223M；或5M(T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A)和D524N的氨基酸置换。64.前述权利要求中任一项的方法，其中所述V型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合至所述逆转录酶的V型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域的V型CRISPR
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Cas融合蛋白，或者所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白为包含融合至所述逆转录酶的II型CRISPR
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Cas效应蛋白结构域的II型CRISPR
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Cas融合蛋白。65.权利要求64的方法，其中所述逆转录酶融合至所述V型CRISPR
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Cas效应多肽或所述II型CRISPR
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Cas效应多肽的C
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末端。66.权利要求65的方法，其中所述逆转录酶融合至所述V型CRISPR
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Cas效应多肽或所述II型CRISPR
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Cas效应多肽的N
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末端。67.前述权利要求中任一项的方法，其中所述逆转录酶融合至一个或多个单链RNA结合结构域(RBD)，由此改善所述逆转录酶的热稳定性、持续能力和模板亲和力。68.权利要求67的方法，其中所述一个或多个单链RNA结合结构域融合至所述逆转录酶的N
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末端，任选地其中所述逆转录酶进一步在其C
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末端处融合至所述II型CRISPR
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Cas效应蛋白和/或V型CRISPR
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Cas效应蛋白的N
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末端。69.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括使所述靶核酸与5'
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3'核酸外切酶相接触。70.权利要求69的方法，其中所述5'
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3'核酸外切酶融合至V型CRISPR
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【专利技术属性】
技术研发人员：Y，
申请(专利权)人：成对植物服务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：