一种同时提取线粒体DNA及蛋白的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种同时提取线粒体DNA及蛋白的试剂盒。本发明专利技术的试剂盒包括：Digitonin缓冲液、NP

【技术实现步骤摘要】
一种同时提取线粒体DNA及蛋白的试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种同时提取线粒体DNA及蛋白的试剂盒，属于生物分离


技术介绍

[0002]线粒体(mitochondrion)是一种存在于真核生物中的由两层膜包被的细胞器，线粒体作为细胞内主要的“能量工厂”而存在，单个细胞内的线粒体可达数百至上千个，这些线粒体是细胞内氧化还原反应的主要场所。线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化，分别对应有氧呼吸的第二、三阶段。细胞质基质中完成的糖酵解和在线粒体基质中完成的三羧酸循环在会产还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinarnide adenine dinucleotide，NADH)和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(reduced flavin adenosine dinucleotide，FADH2)等高能分子，而氧化磷酸化这一步骤的作用则是利用这些物质还原氧气释放能量合成ATP。
[0003]线粒体DNA是线粒体中的遗传物质，呈双链环状。线粒体中拥有一套独特的遗传系统，线粒体DNA与核DNA相互独立的，不会相互影响。线粒体编码的蛋白也与细胞核编码蛋白不尽相同。线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一，在病理上，线粒体与衰老、肿瘤及线粒体相关遗传代谢病息息相关。了解线粒体相关基因的表达对于理解相关疾病至关重要。传统的线粒体DNA或蛋白提取试剂盒为各自独立，需要分别提取，所需要的细胞更多。目前还没有关于一种能够同时提取线粒体DNA及蛋白的试剂盒的相关报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是：为解决现有技术中的线粒体DNA或蛋白提取试剂盒为各自独立，需要分别提取，所需要的细胞更多的技术问题；本专利技术提供了一种能够同时提取线粒体DNA及蛋白的试剂盒，同时还能获得细胞质DNA、细胞质蛋白、核DNA、核蛋白等产物，用于后续的分子生物学分析。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是提供一种线粒体DNA及蛋白提取试剂盒，其包括：Digitonin缓冲液、NP
‑
40缓冲液、悬浮液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；
[0006]其中，所述Digitonin缓冲液含有：Digitonin，NaCl，HEPES，蛋白酶和磷酸酶抑制剂；
[0007]所述NP
‑
40缓冲液含有：NP
‑
40，NaCl，HEPES，蛋白酶和磷酸酶抑制剂；
[0008]所述悬浮液为PBS缓冲液；
[0009]所述裂解液含有：TritonX
‑
100，Tris，NaCl，脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，SDS，蛋白酶和磷酸酶抑制剂；
[0010]所述洗涤液1含有：盐酸胍、Tris
‑
HCl pH 6.6和40％无水乙醇；
[0011]所述洗涤液2含有：NaCl、Tris
‑
HCl pH 7.5和80％无水乙醇；
[0012]所述洗脱液含有：Tris
‑
HCl和EDTA。
[0013]优选地，所述Digitonin缓冲液含有：150mM NaCl，50mM HEPES pH7.4，25μg/ml Digitonin，1％蛋白酶和1％磷酸酶抑制剂；
[0014]和/或，所述NP
‑
40缓冲液含有：150mM NaCI，50mM HEPES pH7.4，1％NP
‑
40，蛋白酶和磷酸酶抑制剂；
[0015]和/或，所述PBS缓冲液的pH值为7.4；
[0016]和/或，所述裂解液含有：1％TritonX
‑
100，50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1％脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，0.1％ SDS，1％蛋白酶和1％磷酸酶抑制剂；
[0017]和/或，所述洗涤液1含有：5M盐酸胍、20mM Tris
‑
HCl pH 6.6和40％无水乙醇；
[0018]和/或，所述洗涤液2含有：20mM NaCl、2mM Tris
‑
HCl pH 7.5和80％无水乙醇；
[0019]和/或，所述洗脱液含有：10mM Tris
‑
HCl和0.1mM EDTA。
[0020]本专利技术还提供了上述线粒体DNA及蛋白提取试剂盒在同时提取细胞中的线粒体DNA及蛋白中的应用。
[0021]本专利技术还提供了一种同时提取线粒体DNA及蛋白的方法，采用上述的线粒体DNA及蛋白提取试剂盒进行提取，包括以下步骤：
[0022]步骤1：取悬浮细胞或贴壁细胞，加入Digitonin缓冲液裂解，然后离心，得上清液和沉淀；
[0023]步骤2：将步骤1离心所得的上清液进行多次离心，收集上清为细胞膜DNA及蛋白，将其分成两管，分别用于提取胞膜DNA及后续的蛋白分析(由于此样品中含有的胞膜DNA不会对后续的蛋白分析产生影响，因此无需进一步分离)；
[0024]步骤3：将步骤1离心得到的沉淀重悬在悬浮液中，以洗去Digitonin缓冲液，然后离心，弃去上清，收集细胞沉淀利用NP
‑
40缓冲液裂解，裂解所得样品离心后得到上清线粒体部分和沉淀，将上清样品分成两管，分别用于提取线粒体DNA及后续的蛋白分析；
[0025]步骤4：将步骤3所得的沉淀利用预冷悬浮液重悬，洗去NP
‑
40缓冲液，将所得样品分成两管，分别用于提取胞核DNA及后续的蛋白分析；
[0026]步骤5：上述步骤2～4所得的用于提取胞膜DNA、线粒体DNA、胞核DNA的样品中加入裂解液进行消化处理，得到消化液，往消化液中加入无水乙醇混匀，室温静置后，转移到有滤芯的离心管中，离心后，弃去管内液体，往滤芯中加入洗涤液1，离心后，弃穿透液，保留滤芯；再往滤芯上加入洗涤液2，离心后，弃穿透液；加入洗涤液洗涤后的滤芯上加入洗脱液，室温静置后，离心，收集滤液，即得相应的DNA样品；
[0027]优选地，所述步骤1中每5
×
105个细胞利用100μl Digitonin缓冲液裂解。
[0028]优选地，所述步骤3中每5
×
105个细胞利用100μl NP
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40缓冲液裂解。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0030]本专利技术的一种同时提取线粒体DNA及蛋白的试剂盒，相对于传统的线粒体DNA或蛋白提取试剂盒为各自独立，需要分别提取，所需要的细胞更多，本专利技术的试剂盒能够同时提取线粒体DNA及蛋白，同时还能获得细胞质DNA、细胞质蛋白、核DNA、核蛋白等产物，方便用于后续的分子生物学分析。
附图说明
[0031]图1为本专利技术的试剂盒提取得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种线粒体DNA及蛋白提取试剂盒，其特征在于，其包括：Digitonin缓冲液、NP
‑
40缓冲液、悬浮液、裂解液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液；其中，所述Digitonin缓冲液含有：Digitonin，NaCl，HEPES，蛋白酶和磷酸酶抑制剂；所述NP
‑
40缓冲液含有：NP
‑
40，NaCl，HEPES，蛋白酶和磷酸酶抑制剂；所述悬浮液为PBS缓冲液；所述裂解液含有：TritonX
‑
100，Tris，NaCl，脱氧胆酸钠，SDS，蛋白酶和磷酸酶抑制剂；所述洗涤液1含有：盐酸胍、Tris
‑
HCl pH 6.6和40％无水乙醇；所述洗涤液2含有：NaCl、Tris
‑
HCl pH 7.5和80％无水乙醇；所述洗脱液含有：Tris
‑
HCl和EDTA。2.根据权利要求1所述的线粒体DNA及蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述Digitonin缓冲液含有：150mM NaCl，50mM HEPES pH7.4，25μg/ml Digitonin，1％蛋白酶和1％磷酸酶抑制剂；和/或，所述NP
‑
40缓冲液含有：150mM NaCI，50mM HEPES pH7.4，1％NP
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40，1％蛋白酶和1％磷酸酶抑制剂；和/或，所述PBS缓冲液的pH值为7.4；和/或，所述裂解液含有：1％TritonX
‑
100，50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％蛋白酶和1％磷酸酶抑制剂；和/或，所述洗涤液1含有：5M盐酸胍、20mM Tris
‑
HCl pH 6.6和40％无水乙醇；和/或，所述洗涤液2含有：20mM NaCl、2mM Tris
‑
HCl pH 7.5和80％无水乙醇；...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡正阳，隋启海，金星，陈振淙，林宗武，詹成，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：